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自噬抑制剂氯喹对大鼠肾脏草酸钙晶体形成的作用及机制研究
目的 探讨自噬抑制剂氯喹对大鼠肾脏草酸钙晶体形成的影响及可能机制.方法 2016年9月至2016年10月将30只SPF级健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组和干预组,每组10只.对照组大鼠自由饮用灭菌水.模型组应用乙二醇和氯化铵诱导法建立大鼠肾脏草酸钙结石模型.干预组在造模的基础上,予腹腔注射氯喹40 mg/(kg·d).造模28 d后收集各组大鼠24 h尿液和肾脏,应用偏光显微镜检测肾脏草酸钙晶体数量,应用透射电镜检测肾脏的自噬小体数量,应用全自动生化仪及离子色谱仪检测尿液中钙、镁、草酸及枸橼酸的含量,通过免疫组化染色法检测肾脏自噬标志物LC3、P62以及肾损伤标志物SOD、MCP-1及8-OHdG的表达情况,并采用RT-PCR检测肾脏草酸转运体SLC26A6的表达变化.结果 与模型组相比,干预组大鼠肾脏草酸钙晶体数量明显减少[(32.37±5.14)个/HP与(4.18±0.25)个/HP,P＜0.05].与对照组相比,模型组肾脏自噬水平明显升高;而与模型组相比,干预组肾脏自噬水平则明显降低.对照组、模型组、干预组的尿草酸排泄量分别为:(3.1±1.5)、(22.5±8.1)、(2.8±1.2) mmol,尿枸橼酸排泄量分别为:(63.4±7.4)、(45.9±9.5)、(15.6±8.2)mmol;与对照组相比,模型组的尿草酸明显增高(P＜0.05),干预组的尿枸橼酸明显降低(P＜0.05);与模型组相比,干预组的尿草酸和尿枸橼酸均明显减低(P＜0.05).对照组、模型组和干预组肾脏的SOD表达量分别为:42.24±4.16、19.21 ±2.25、39.08±3.53;MCP-1表达量分别为:4.02±0.51、8.45±0.55、5.52±0.34;8-OHdG表达量分别为:7.16 ±0.54、11.21±1.12、8.67±0.34.与对照组相比,模型组的SOD表达量明显降低(P＜0.05),MCP-1和8-OHdG表达量明显升高(P＜0.05).与模型组相比,干预组的SOD表达量明显升高(P＜0.05),MCP-1和8-OHdG表达量则明显降低(P＜0.05).对照组、模型组和干预组肾脏SLC26A66表达量分别为0.35±0.07,1.02±0.17和0.70±0.06.与对照组相比,模型组SLC26A6表达量明显升高(P＜0.05);与模型组相比,干预组大鼠SLC26A6表达量明显降低(P＜0.05).结论 自噬抑制剂氯喹可以明显抑制乙二醇诱导的大鼠肾脏草酸钙晶体的形成,作用机制可能与其抑制肾脏草酸转运体SLC26A6的表达,以及抑制肾组织的自噬水平和损伤程度,从而降低尿草酸的水平有关.
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幽门螺杆菌感染对十二指肠黏膜上皮细胞碳酸氢盐转运蛋白表达的影响
目的 探究幽门螺杆菌(HP)感染对小鼠十二指肠上皮细胞碳酸氢盐转运蛋白表达的影响.方法 C57小鼠随机分为四组,三组分别给予HP菌株SS1、NCTC11637、NCTC11639感染,一组仅给予同等量的磷酸盐缓冲液(PBS)灌胃(对照组),2 w后收集组织.体外培养十二指肠上皮细胞,与HP菌株共培养,其中对照组给予等量PBS干预,收集细胞.应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)及Western印迹检测组织及细胞中碳酸氢盐转运蛋白表达的影响.结果 HP感染小鼠后,由吉姆萨染色镜检见,感染后可见大量紫蓝色小体,呈逗点状、短棒状;细胞实验:HP菌株NCTC11637与十二指肠上皮细胞共培养后应用RT-PCR扩增HP16srRNA,小鼠及细胞实验均目的基因为单一扩增,扩增良好.小鼠及细胞实验均3种HP菌种囊性纤维跨膜传导调节因子(CFTR)、离子交换体(SLC)26A3及SLC26A6感染2w后,碳酸氢盐转运蛋白mRNA及蛋白表达显著低于对照组(P<0.05).结论 从体内到体外,HP可通过调控碳酸氢盐转运蛋白含量来干预疾病的进展.
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草酸转运基因变异的分子结构分析
目的 评估草酸转运SLC26a6基因rs184187143位点变异的分子结构改变.方法 从NCBI基因数据库获得人类SLC26a6基因序列,nsSNP信息从NCBI dbSNP数据库获得,同源建模SLC26a6的STAS结构域并评估建模质量,构建rs184187143野生型和突变型的STAS结构域,用GROMACS 4.6.4软件运行分子动力学模拟100 ns.分析轨迹文件指标包括均方根偏差(root mean square deviation,RMSD),均方根涨落(root mean square fluctuation,RMSF),溶剂可及表面积(solvent accessible surface area,SASA)和回转半径(radius of gyration,Rg).结果 SLC26a6蛋白的STAS结构域二级结构有4个 α 螺旋和6个 β 片层,致病性突变G539R定位在 α 螺旋1的近端.野生型的RMSD在100 ns时的值低于变异型(P=0.02),RMSF未显示有明显构象变化,SASA值比变异型更高,Rg曲线比变异型处于较低的位置.主成分分析显示野生型STAS结构域比变异型覆盖更大的区域.结论 与野生型相比G539R变异型导致STAS结构域稳定性和弹性减弱.
