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针对肠道病毒71型的新型重组融合蛋白类病毒颗粒疫苗研制及其免疫效果评价
目的 研制针对肠道病毒71型(EV71)的新型重组类病毒颗粒疫苗,并评价其免疫效果.方法 利用诺如病毒(NoV)衣壳蛋白(VP1)P区(NoVP)可呈现外源抗原并形成类病毒颗粒的特点,构建获得只包含NoVP或在其表面环位点串联插入EV71衣壳蛋白的三个特异性抗原位点(VP1的SP55和SP70,VP2的VP2-28)基因片段,克隆至质粒pET-28a(+)后分别转化大肠杆菌后诱导表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹和透射电镜鉴定和观察表达的重组融合蛋白(NoVP+ EV71-SP55-SP70-VP2-28)和NoVP蛋白.同时,采用随机分组法将BALB/C小鼠分成A、B和C三组,每组10只,分别用重组融合蛋白(NoVP+ EV71-SP55-SP70-VP2-28)、NoVP和透析液免疫获得抗血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中特异性抗体;将小鼠血清与EV71 H3-TY株混合,加入Vero细胞,通过微量中和实验检测特异性抗体效价.采用方差分析和Bonferroni检验对数据进行分析.结果 重组表达产物在大肠杆菌中以包涵体形式存在,SDS-PAGE显示重组融合蛋白和NoVP相对分子质量约为43×103和36×103;免疫印迹显示重组融合蛋白在相对分子质量约为43×103处有特异性条带,透射电镜观察显示重组融合蛋白呈现类病毒颗粒.ELISA显示与SP70多肽反应的小鼠血清吸光度(A490)值A组明显大于B组和C组(F=13.860,P＜0.05);微量中和实验显示A组小鼠血清针对EV71 H3-TY株的几何平均中和滴度为1∶38.结论 本研究初步获得了针对EV71的一种新型重组融合蛋白类病毒颗粒疫苗,其具有良好的抗原性和特异性,能诱导小鼠产生较高中和滴度的特异性抗体.
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rRT-PCR与微量中和实验法用于脊灰病毒血清定型的比较
目的 对实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PC R)法和微量中和实验2种脊灰病毒的血清型鉴定方法进行评价.方法 按世界卫生组织(WH0)《脊髓灰质炎实验室手册》第4版进行病毒分离,用rRT-PCR法和微量中和实验方法对分离到的L20B阳性分离物进行PV的血清型鉴定,用rRT-PCR法进行型内鉴定.结果 rRT-PCR法与微量中和实验对L20B阳性分离物进行脊灰病毒的血清型定型,2种方法检测脊灰病毒阳性率差异无统计学意义,检测NPEV阳性率差异也无统计学意义;rRT-PCR方法检测脊灰病毒的灵敏度为100％,特异度为100％;检测NPEV的灵敏度为63.16％,特异度为100％.结论 作为WHO推荐使用的新的型内鉴定方法,rRT-PCR法对于脊灰病毒的血清型定型与常规微量中和实验一致率为100％,该方法方便快捷,可以缩短检测时限;对于NPEV的检测特异度较高,但灵敏度低于微量中和实验.
