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海肾荧光素酶基因标记肝癌细胞生物发光成像在小鼠肝癌活体示踪中应用
目的 探讨海肾荧光素酶(Rluc)标记肝癌细胞生物发光成像在小鼠肝癌活体示踪中应用价值.方法 构建Rluc基因标记的Rluc-GFP-Hepa1-6肝癌细胞,利用流式细胞仪分选GFP表达阳性的稳定细胞;Rluc-GFP-Hepa1-6细胞行细胞生物发光成像,分析生物发光信号强度与细胞数量间相关性;同时将Rluc-GFP-Hepa1-6细胞接种于裸鼠皮下,建立移植瘤模型,行活体生物发光成像,定量监测肿瘤细胞在体内的生长过程.发光信号强度与细胞数量及肿瘤体积间关系采用线性回归分析.结果 成功构建Rluc-GFP-Hepa1-6细胞株,经流式细胞仪分选后获得GFP阳性率高达95%的Rluc-GFP-Hepa1-6细胞.细胞生物发光成像结果显示,Rluc-GFP-Hepa1-6细胞发光信号强度与细胞数量间有相关性(R2=0.999).活体生物发光成像显示,皮下肿瘤的发光信号强度与肿瘤体积存在正相关性(R2=0.887).结论 应用Rluc生物发光成像可成功监测小鼠肝癌皮下肿瘤模型的演进过程,不仅为研究肝癌体内生长、转移、治疗提供了理想的模型,而且为进一步研究肝癌的治疗效果提供了良好、无创的定量示踪手段.
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Rluc报告基因在大肠杆菌中的表达及检测条件优化
目的 研究海肾荧光素酶报告基因(Rluc)在大肠杆菌中的表达情况及优化检测条件.方法 将Rluc克隆入大肠杆菌JM109,提取质粒后用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切,并与制备好的pET-30a(+)载体连接,再转化入大肠杆菌BL21.然后用ViviRen底物检测不同稀释液、不同浓度及时间等情况下重组克隆子中Rluc报告基因的荧光表达量,绘制表达曲线.结果 成功构建了Rluc在B121中的表达克隆子;ViviRen底物用PBS稀释比用LB稀释的检测灵敏度高约2倍;荧光检测的表达曲线在底物加入后迅速上升,至10min时达高峰,然后缓慢下降;阳性克隆子中Rluc的荧光表达线性检测范围广,阴性对照菌株中背景低;总结出了ViviRen底物用PBS稀释、荧光信号在10min后进行瞬时测定等优化检测条件.结论 Rluc报告基因可在大肠杆菌内高效表达,检测方法 具有特异性好、灵敏度高等特点.
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分子生物学中报告基因的主要类型及应用现状
报告基因技术在分子生物学领域中已经广泛应用于基因表达调控、启动子活性分析、信号转导、受体功能鉴定以及基因治疗、药物筛选等领域,而且随着技术和检测方法的进步,不断有新的更加灵敏和非损伤性的报告基因出现,尤其是一些不影响细胞繁殖、能够实时检测的荧光报告基因的发展更为迅速.该文从报告基因的使用现状出发,对其主要的种类、特征、应用及发展趋势进行论述.
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pRluc-hNeurotensin1-R重组真核表达载体的构建及在离体细胞中的表达
目的 构建与海肾荧光素酶(Rluc)融合的人Neurotensin-R1(Human Neurotensin receptor1,NTS1 or NTSR1)真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法检测人NTS与其它受体间的相互作用以及研究Neurotensin-R介导的细胞内信号转导机制.方法 以质粒pcDNA3.1-hNTS1为模板,PCR方法扩增人NTS.扩增的人NTS以及质粒pRluc-pcDNA3.1用Not Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切,然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌Top10中,该菌在培养箱中孵育12 ～ 16h后,挑取菌落培养,提取质粒,进行酶切鉴定,后进行测序.将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(human embryonic kidney293,HEK293)细胞.后,通过共聚焦显微镜观察经过免疫荧光染色的细胞以及Western blot鉴定人Neu-rotensinl-R的表达.结果 通过PCR扩增出一条1257bp的基因片段,序列与GenBank (NM_002531)相同.Western blot中大约90kDa处有一蛋白条带,与预期大小相同.人Neurotensin-R表达在细胞膜上.结论 成功构建了pRluc-hNeurotensinl-R重组表达载体,建立了该质粒转染HEK293的细胞模型.可被用于检测与其它受体间的相互作用以及研究Neurotensin1-R介导的细胞内信号转导机制,这将有助于探究疾病的发病机制及开发新的药物靶点.
