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在酵母中异源表达人破骨细胞钠氢转运蛋白
目的 在酿酒酵母中异源表达人破骨细胞分化成熟潜在因子钠氢转运蛋白2(HsNHA2),鉴定其作为盐离子载体转运Na+的功能,并对其在细胞中的表达进行初步定位分析.方法 采用高保真PCR试剂盒扩增出HsNHA2；构建酵母表达载体,通过电穿孔的方式转入到酿酒酵母菌株中；Western印迹检测其在酵母菌株的表达；通过NaCl选择压力观察菌株在高盐环境中的生长表型,并用根皮素抑制HsNHA2观察其抗盐功能；后用细胞原位荧光染色确定HsNHA2在细胞中的表达位置.结果 Western印迹证实HsNHA2在酵母菌株中正常表达；生长曲线显示HsNHA2可使菌株在高盐环境中生长,根皮素抑制HsNHA2表达后菌株不能在0.2mol/L NaCl培养基中生长；免疫荧光染色初步证明HsNHA2表达在细胞膜上.结论 HsNHA2作为盐离子载体在酵母细胞中主要表达在细胞膜上行使转运Na+的功能,以维持细胞正常生长.
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破骨细胞钠氢转运蛋白集中于线粒体中表达
目的:把RAW264.7和人外周血CD14+诱导成破骨样细胞,检测破骨细胞在成熟过程中钠氢转运蛋白2(Na+-H+ Antiporter 2,NHA2)的转录表达情况,并定位其表达位置.方法:细胞因子RANKL、M-CSF在体外诱导RAW264.7和人外周血CD14+细胞发育成破骨样细胞;RT-PCR检测NHA2在诱导过程中转录水平上所发生的变化；Western blot检测诱导前后此蛋白表达情况;细胞原位荧光染色对其表达进行细胞精确定位.结果:RAW264.7和人外周血CD14+细胞被RANKL、M-CSF诱导成破骨样细胞;RT-PCR结果显示NHA2随着破骨细胞的分化成熟转录水平不断加强；Western blot结果显示此蛋白只表达于成熟的破骨细胞中;细胞原位荧光染色结果显示这个蛋白主要表达于成熟破骨细胞的线粒体中.结论:NHA2作为盐离子载体主要表达于成熟破骨细胞的线粒体中,通过控制线粒体盐离子的代谢平衡来影响破骨细胞的发育分化.
