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结直肠癌组织中胸苷磷酸化酶表达与5'-脱氧氟尿苷靶向治疗的关系
胸苷磷酸化酶(TP)是嘧啶和核苷代谢过程中的关键酶,近年发现其具有肿瘤血管新生作用,并与肿瘤病人的预后转归密切相关.同时TP还是5'-脱氧氟尿苷(5'-DFUR,商品名为氟铁龙)抑制肿瘤细胞生长的关键转化酶.目前,TP在结直肠癌细胞中是否表达尚无定论,但因其对肿瘤血管新生及增进5'-DFUR治疗效果的双重作用而倍受临床关注.文中对TP在结直肠癌组织中的表达与5'-DFUR细胞内激活、治疗的研究进展进行综述.
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慢病毒转染胸苷磷酸化酶基因增强5'-脱氧氟尿苷抗结肠癌细胞活性
目的 探讨5’-脱氧氟尿苷(5’-DFUR)和氟尿嘧啶(5-Fu)对人结肠癌细胞株HT29和LS174T转染胸苷磷酸化酶(TP)基因前后抗癌效应的变化.方法 构建包含TP基因的慢病毒载体,转染结肠癌细胞株HT29和LS174T.传代5代后,以流式细胞术检测转染效率.免疫组织化学染色和Western blot检测转染TP基因前后HT29和LS174T细胞中TP蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞中TP mRNA的表达水平,四唑氮化合物法检测5’-DFUR和5-Fu对转染TP基因前后细胞株的半数抑制浓度(IC50),高效液相色谱(HPLC)法检测HT29和LS174T在细胞转染TP基因前后转化5'-DFUR为5-Fu的水平.结果 转染TP基因的HT29和LS174T细胞传代5代后,转染效率稳定在约95.0％.转染TP基因的HT29和LS174T细胞中TP表达阳性,而野生型细胞和仅转染病毒载体细胞中TP表达阴性;Westem blot结果显示,HT29和LS174T细胞中TP蛋白的表达明显增强.RT-PCR结果显示,转染TP基因的HT29和LS174T细胞中TP mRNA的相对表达水平分别为8.45 ±0.15和2 615.02±253.97,与野生型细胞比较,差异均有统计学意义(均P＜0.01).5 '-DFUR对转染TP基因的HT29-TP细胞和野生型细胞的IC50分别为(14.33±0.74) μmol/L和(707.66±5.66) μmol/L(P ＜0.05);对转染TP基因的LS174T-TP细胞和野生型细胞的IC50分别为(0.59±0.11)μmol/L和(239.20 ±21.83) μmol/L(P＜0.05).5-Fu对转染TP基因的HT29-TP细胞和野生型细胞的IC5o分别为(5.42±0.75) μmol/L和(14.19 ±0.97) μmol/L(P ＜0.05);对转染TP基因的LS 174T-TP细胞和野生型细胞的IC50分别为(4.41±0.96) μmol/L和(16.42±2.12) μmol/L(P＜0.05).转染TP基因后的HT29和LS174T细胞培养基中,则检出大量转化的5-Fu,较转染前分别增加了12.2 ～23.6倍,差异均有统计学意义(均P＜0.01).在细胞裂解液中也检出有少量5-Fu,但其水平仅相当于培养基中的0.9％ ～4.2％.结论 以慢病毒为载体将TP基因转染至人结肠癌细胞HT29和LS714T,能得到转染效率高和稳定传代的细胞株,并且2株细胞的TP蛋白和TP mRNA的表达水平明显增高.转染后在培养基中转化的5-Fu水平明显增高,使5-Fu和5’-DFUR对HT29和LS714T细胞的抗癌作用明显增强,但5’-DFUR增强效果更加明显.
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5'-脱氧氟尿苷联合干扰素对转染TP基因结肠癌细胞株裸鼠实验模型的影响
背景与目的:人结直肠癌细胞基本无胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)表达.本实验主要探讨人结肠癌细胞株LS174T转染TP基因后,在裸鼠肿瘤组织中对抗癌药物5'-脱氧氟尿苷(5'-deoxy-5-fluorouridine,5'-DFUR)、氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和干扰素-α2a(interferon-α2a,INF-α2a)干预效果的影响.方法:以慢病毒为载体转染TP基因至结肠癌细胞株LS174T,得到稳定传代的高TP表达株.将96只BALB/c裸鼠分成2组,分别应用野生型及转染TP基因后的LS174T细胞株接种裸鼠背部皮下,制成结肠癌TP低、高表达模型.每组再随机分为6组,分别应用0.9％NaCl溶液、INF-α2a、5-FU、5-FU+INF-α2a、5'-DFUR和5'-DFUR+INF-α2a干预5 d,2周后处死裸鼠,分离肿瘤称重后,分别应用鼠抗人CD34、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和抗PD-ECGF单克隆抗体进行免疫组织化学染色.判定是否有TP表达及对微血管进行计数.结果:在野生型LS174T裸鼠荷瘤模型中,使用抗肿瘤药物的3～6组肿瘤质量与对照组相比均明显降低,抑癌率分别为48％、27％、48％和57％,差异有统计学意义(P<0.05).其中5'-DFUR组(48％)与5'-DFUR+INF-α2a组(57％)、5-FU+INF-α2a组与5'-DFUR+INF-α2a组(27％与57％)相比,抑癌率差异有统计学意义(P<0.05).在LS174T-TP细胞株裸鼠模型中,5'-DFUR组和5'-DFUR+INF-α2a组抑癌率分别为27％和48％,而使用5-FU的两组未显示出良好的抗肿瘤效果(7％和3％).免疫组织化学染色显示,野生型LS174T接种形成的肿瘤组织中TP表达阴性,微血管数目较少,而转染TP基因后,肿瘤组织中TP表达明显上升,微血管密度明显增多(P<0.05).结论:结肠癌细胞株LS174T转染TP基因后,在裸鼠实验肿瘤模型中,TP表达明显增加,使细胞内激活抗癌药物5'-DFUR的抗癌作用明显增强,联合应用INF-α2a能进一步增强这种抗癌作用.而转染TP基因或联合应用INF-α2a对常规抗癌药物5-FU的抗癌效果无明显影响.
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转染胸苷磷酸化酶基因对5'-脱氧氟尿苷抑制结肠癌细胞的影响
目的 探讨转染胸苷磷酸化酶(TP)cDNA对5’-脱氧氟尿苷(5’-DFUR)抑制人结肠癌细胞LOVO作用的影响.方法 将TP cDNA序列克隆以慢病毒表达载体包装后转染人结肠癌细胞LOVO(LOVO-TP组),另设空白对照组和LOVO-载体组.以流式细胞仪检测3组细胞转染效率,RTPCR法检测3组细胞TP mRNA表达;Western blot法检测转染前后TP蛋白水平；MTT法检测转染前后LOVO对5’-DFUR药物敏感性的变化；高效液相色谱法(HPLC)检测3组细胞转化不同浓度5'-DFUR生成5-FU量的情况.结果 转染TP基因并传代5代后,LOVO细胞的转染效率在95％左右.转染TP基因后,LOVO-TP组的TP mRNA表达水平为空白对照组的(282.5±86.8)倍(P＜0.01),而LOVO-载体组与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；Western blot检测显示,LOVO-TP组的TP蛋白表达明显高于对照组和LOVO-载体组.5’-DFUR对LOVO细胞半数有效剂量(IC50)对照组为(1607.3±56.8) μmol/L,明显高于LOVO-TP组的(1087.7±89.1) μmol/L(P＜0.01)；而LOVO-染载体组为(1699.5±38.7)tμmol/L,与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).培养基中分别加入0、500、1000和2000 μmol/L的5'-DFUR后,对照组培养基中分别检出0、2.10、3.13和7.19 μmol/L的氟尿嘧啶(5-FU)；而在LOVO-TP组的细胞培养基中则分别检出0、22.16、30.94和40.02 μmol/L的5-FU;而LOVO-载体组的培养基中则几乎无5-FU检出.结论 转染TP cDNA能够明显提高LOVO细胞的TP mRNA及TP蛋白表达水平,使细胞外5’-DFUR转化为5-FU增多,明显提高5’-DFUR对LOVO的细胞毒性作用.
