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肿瘤学/病理学文献资料
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抑制性消减杂交构建凋亡肝癌细胞差异表达cDNA文库
目的应用抑制性消减杂交技术构建肝癌细胞凋亡消减杂交cDNA文库,以期克隆肝癌细胞凋亡相关基因.方法用三氧化二砷诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡,提取poly A+RNA,反转录合成cDNA,消化成短片段后分成两组,分别与两种不同的接头连接,再与普通肝癌细胞的cDNA进行两次杂交及两次抑制性PCR扩增,将PCR产物与PT-Adv线性载体连接,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆进行酶切鉴定,反向Northern blot分析差异基因的可靠性.结果成功地构建了具有高消减效率的人肝癌凋亡细胞cDNA文库,随机挑取200个克隆制备质粒并酶切分析,其中83,5%的克隆均具有100bp 600bp左右的插入片段.随机选取30个插入片段,分别以未凋亡和凋亡的肝癌细胞cDNA为探针,进行Reverse Northern Blot,其中21个被证明为差异表达的细胞凋亡相关基因cDNA片段结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了人肝癌凋亡细胞cDNA消减文库,为大批量筛选、克隆肝癌细胞凋亡相关的未知新基因奠定了基础,有助于了解细胞凋亡的分子机制