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幽门螺杆菌感染通过核因子κB信号通路调控Fas相关因子1表达的相关机制
目的:探讨幽门爆杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染对敲除核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路上KKβ、p65基因后过表达Fas相关因子1(Fas-associated factor 1,FAF1)胃癌细胞的影响,进一步明确H.pylori致癌的相关机制.方法:构建针对IKKβ、p65的siRNA慢病毒载体(LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi),转染过表达FAF1的HGC-27细胞,实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblot)法检测转染前后IKKβ、p65、FAF1mRNA和蛋白表达.应用CCK8法检测转染后细胞增殖能力的变化.用H.pylori培养滤液感染基因敲除细胞,用RT-PCR和Westernblot法检测H.pylori感染前后IKKβ、p65、FAF1 mRNA和蛋白表达.结果:成功将LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi和阴性对照(LV-NC-RNAi)转染入过表达FAF1胃癌细胞,转染后72h,LV-IKKβ-RNAi和LV-p65-RNAi组IKKβ和p65 mRNA和蛋白表达显著低于LV-NC-RNAi组和未转染组(均P＜0.01);转染前后各组间FAF1 mRNA和蛋白表达无显著差异(P＞0.05).LV-IKKβ-RNAi组和LV-p65-RNAi组细胞增殖能力升高(P＜0.01).H.pylori感染后LV-IKKβ-RNAi组和LV-p65-RNAi组IKKβ、p65mRNA和蛋白表达与感染前相比无显著差异(P＞0.05),而LV-NC-RNAi组和未转染组IKKβ、p65 mRNA和蛋白表达都显著高于感染前(P＜0.01).H.pylori感染后LV-IKKβ-RNAi组和LV-p65-RNAi组FAF1 mRNA和蛋白表达与感染前相比无显著差异(P＞0.05),而LV-NC-RNAi组和未转染组FAF1 mRNA和蛋白表达显著低于感染前(P＜0.01).结论:H.pylori感染可能通过介导NF-κB信号通路下调抑癌因子FAF1的表达,进而导致胃癌的发生.
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过表达FAF1基因慢病毒构建及对人胃癌细胞凋亡影响
目的:构建过表达FAS相关因子1(fas-associated factor 1,FAF1)基因的慢病毒载体,探讨其对胃癌细胞凋亡的影响.方法:RT-PCR法扩增FAF1 cDNA,亚克隆至GV218质粒中,经酶切及DNA测序鉴定正确以后,把含有FAF1基因的重组质粒与pHelper1.0和pHelper2.0载体质粒转染至293T细胞包装慢病毒.用包装好的慢病毒感染人胃癌细胞HGC-27,Real time PCR和蛋白质印迹法检测转染前后FAF1基因和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡的改变.结果:FAF1基因扩增产物长度为1 996 bp,酶切及测序结果鉴定GV218-FAF1质粒构建正确,成功包装的慢病毒滴度为2×108 TU/mL.HGC-27细胞转染FAF1过表达慢病毒48 h后,细胞形态由长梭形变得不规则.过表达FAF1慢病毒转染组FAF1基因mRNA表达水平2.436±0.538,是阴性对照组1.086±0.226的2.24倍,P＜0.001;是空载转染组1.182±0.381的2.06倍,P＜0.001.过表达FAF1慢病毒转染组FAF1蛋白相对表达水平1.515±0.377,显著高于阴性对照组的0,P＜0.001;也显著高于空载转染组的0,P＜0.001.过表达FAF1慢病毒转染组凋亡率(84.66±5.92)％显著高于阴性对照组的(4.60±3.80)％,P＜0.001;也显著高于空载转染组的(7.32±3.82)％,P＜0.001.结论:成功构建并鉴定FAF1基因过表达慢病毒载体,FAF1基因表达上调使胃癌细胞凋亡增加.
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幽门螺杆菌感染对人胃癌细胞HGC-27和人胃黏膜上皮细胞GES-1FAS相关因子1表达的影响
目的 探讨Fas相关因子l(FAF1)基因表达与幽门螺杆菌感染(Hp)及胃癌发生之间的关系.方法 人胃癌细胞株HGC-27、人胃黏膜上皮细胞GES-1 8×105个与Hp标准菌株NCTC11637共培养24h,按细胞/细菌比分为3组:空白对照组、1∶100和1∶200共培养组,每组实验设3个复孔,采用噻唑蓝(MTT)比色法490 nm波长处测量吸光度值计算细胞存活率,流式细胞仪检测l×104个细胞凋亡率,荧光实时定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测细胞FAFl mRNA相对表达量,扩增片段长度为164 bp.结果 HGC-27和GES-1细胞与Hp共培养后,细胞增殖均减少,凋亡率增加.与各自空白对照组比较,FAFl mRNA在HGC-27细胞1∶100和1∶200共培养组表达量明显降低(0.67 ±0.20比0.99 ±0.27,F=11.51,P＜0.05;0.44 ±0.30比0.99±0.27,F=11.51,P＜0.01);FAFl mRNA在GES-1细胞1∶100共培养组表达量明显升高(1.61 ±0.77比0.99 ±0.41,F=14.45,P＜0.05),1∶200共培养组表达量明显降低(0.36 ±0.22比0.99±0.41,F=14.45,P＜0.05).与GES-1细胞空白对照组、1∶100和1∶200共培养组比较,FAF1 mRNA在HGC-27相应各组表达量均明显降低(0.33 ±0.16比0.99 ±0.41,t =4.74,P＜0.01;0.17±0.12比1.08 ±0.53,t=5.28,P＜0.01;0.39 ±0.24比0.98±0.23,t=5.67,P＜0.01).结论 Hp感染下调FAF1基因表达,导致细胞增殖和凋亡失衡,诱发胃癌的发生.
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Fas相关因子1的研究进展
Fas相关因子1(Fas-associated factor 1,FAF1)是一种细胞内蛋白质,在不同细胞中可存在于细胞核、核仁及核周细胞质中[1-3].FAF1是一种进化上保守的蛋白质,约74 kD,由650个氨基酸组成,含有多个功能结构域,包括Fas作用结构域(Fas-interacting domain,FID)、死亡效应结构域作用结构域(death effecter domain-interacting domain,DEDID)、泛素样调节X结构域(ubiquitin-like regulatory X domain,UBX)等[4].
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不同浓度幽门螺杆菌对胃癌细胞增殖凋亡及FAF1 mRNA表达的影响
目的 研究不同浓度幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)感染对人胃癌细胞HGC-27生长及Fas相关因子1(fasassociated factor 1,FAF1)mRNA表达的影响,探讨Hp致胃癌发生的分子机制.方法 人胃癌细胞HGC-27与不同浓度Hp标准菌株NCTC11637共培养24h,根据感染复数(细胞/细菌比)分为1:1共培养组、1:50共培养组、1:100共培养组、1:200共培养组及对照组(未与Hp共培养),采用噻唑蓝(MTT)比色法测定0h、12 h、24 h、48 h的OD值,绘制细胞生长曲线.共培养24 h后以流式细胞仪检测细胞凋亡率,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测HGC-27细胞FAF1 mRNA的相对表达量,比较不同浓度Hp感染前后FAF1 mRNA表达的变化.结果 经革兰氏染色及生化实验证实培养细菌为Hp.与对照组相比,共培养12 h时,1:50共培养组细胞增殖活性升高(P＜0.05),1:1共培养组、1:100共培养组及1:200共培养组细胞增殖活性低于对照组(P＜0.05);共培养24h、36 h、48 h时,各共培养组细胞增殖活性均低于对照组(P＜0.05).共培养24 h时,1:1共培养组及1:50共培养组细胞凋亡率及FAF1 mRNA的相对表达量与对照组比较,差异无统计学意义(P均＞0.05);1:100共培养组及1:200共培养组细胞凋亡率明显升高,FAF1 mRNA的相对表达量较对照组明显降低(P＜0.05).结论 Hp感染可导致胃癌细胞增殖凋亡失衡,下调胃癌细胞FAF1 mRNA的表达,FAF1mRNA的表达量与Hp的感染浓度有关,FAF1 mRNA的表达下调可能是Hp致胃癌发生的机制之一.
