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核包膜蛋白gp210、p62和LBR自身抗原基因克隆表达及其抗体诊断原发性胆汁性肝硬化的价值初探
目的克隆人核包膜蛋白自身抗原gp210、p62和LBR基因,构建重组表达质粒,获得具免疫学活性的纯化重组蛋白,建立酶联免疫吸附法(ELISA),初探抗核包膜蛋白gp210、p62和LBR自身抗体在原发性胆汁性肝硬化(PBC)诊断中的意义.方法构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21、M15中表达;融合蛋白经Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹法(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA,检测60名健康体检者、68例原发性胆汁性肝硬化(PBC)、60例病毒性肝炎、60例结缔组织病患者血清中抗gp210、p62和LBR抗体.结果经重组质粒测序和酶切结果证实,gp210、p62和LBR目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;SDS-PAGE检测表达产物分别在69 000、62 000 和27 000处有一明显的蛋白表达条带,WB分析表明重组蛋白具有人gp210、p62和LBR抗原反应性.ELISA检测标本血清结果显示,PBC中,抗gp210抗体、抗p62抗体和抗LBR抗体阳性率分别为36.8%、30.9%和5.9%;而病毒性肝炎组、结缔组织病组和健康体检组中,除抗gp210抗体在结缔组织病患者中阳性率为1.7%外,3种自身抗体检测结果均为阴性.PBC组3种自身抗体阳性率与疾病对照组及正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05和P<0.01).结论本研究成功克隆人核包膜蛋白自身抗原gp210、p62和LBR基因,并将其在大肠杆菌中成功表达.应用纯化融合蛋白建立的ELISA检测抗gp210抗体、抗p62抗体和抗LBR抗体,对PBC具有较好特异性,为PBC的特异性临床诊断提供了有效的工具.
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对《核包膜蛋白gp210、p62和LBR 自身抗原基因克隆表达及其抗体诊断原发性胆汁性肝硬化的价值初探》一文的商榷
编辑同志:贵刊2005年第11期刊登了李永哲等《核包膜蛋白gp210、p62和LBR 自身抗原基因克隆表达及其抗体诊断原发性胆汁性肝硬化的价值初探》一文,在阅读过程中,发现有些表述欠妥,特提出与作者商榷.
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答复《对核包膜蛋白gp210、p62和LBR 自身抗原基因克隆表达及其抗体诊断原发性胆汁性肝硬化的价值初探一文的商榷》
编辑同志:拜读编辑部转来的胡红焱读者的来信,信中所提问题绝大部分是正确的,大多为论文写作及编辑过程疏忽造成所出现的低级错误,以后应从中吸取教训.请转达我对读者严谨认真的科学态度的敬意和谢意.现对胡红焱读者所提出的问题逐条答复如下.
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核包膜蛋白gp210自身抗原基因的克隆、表达、纯化及其临床应用
目的 研究核包膜蛋白gp210基因在大肠杆菌中的稳定表达、纯化和免疫学活性鉴定.方法 从人外周血单个核细胞中提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增gp210蛋白中含优势表位的基因片段.将该段基因克隆入PET30a表达载体并转化到大肠杆菌BL21中表达.融合蛋白经Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE电泳及ELISA方法进行鉴定.结果 在原核表达载体中成功构建了PET30a-gp210重组体.重组体诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析可见在相对分子量大约69 kD处有gp210融合蛋白的高效表达,经纯化获得纯度达90%的表达蛋白.ELISA检测结果显示该重组蛋白具有较好的抗原性和特异性.结论 应用基因工程方法,获得了gp210重组蛋白,为检测抗gp210抗体提供了特异性抗原,也为临床将抗gp210抗体作为PBC的特异性诊断指标奠定了基础.
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10例原发性胆汁性肝硬化患者临床与实验室指标分析
目的 研究M2亚型抗线粒体抗体(AMA-M2)、核包膜蛋白(GP210)及核多点抗体(SP100)对原发性胆汁性肝硬化(PBC)的诊断价值.方法 分析10例PBC患者的临床表现、肝功能及免疫学指标、自身抗体及伴发的其他自身免疫性疾病.结果 10例PBC患者中,7例AMA-M2阳性,4例GP210阳性,1例SP100阳性,3例AMA-M2阴性的患者分别检测到了SP100、GP210抗体.结论 SP100、GP210与传统AMA-M2同时检测可增加对PBC诊断的特异性并提高PBC的检出率.
关键词: 原发性胆汁性肝硬化 M2亚型抗线粒体抗体 核包膜蛋白 核多点抗体 诊断