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溶血磷脂酸对背根神经髓鞘相关糖蛋白表达的影响及机制的研究
目的:探讨单次鞘内注射溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对背根神经髓鞘相关糖蛋白(myeline-associated glycoprotein,MAG)表达的影响以及其作用机制;方法:实验1:C56雄性小鼠随机分为人造脑脊液(artificial cerebralspinal fluid,aCSF)组和LPA组,在注射后24小时、3天和7天处死小鼠取其背根神经(dorsal root,DR),采用原位杂交(western blot,WB)方法测定DR中MAG的表达.实验2:C56雄性小鼠随机分为aCSF组,LPA组,钙蛋白酶抑制剂X(calpain inhibitor X,CalX)+LPA组和aCSF+CalX组,在注射后0天、24小时、3天、7天和14天测定小鼠机械性阈值及热阈值.实验3:C56雄性小鼠随机分为aCSF组,aCSF+LPA组和CalX+LPA组,在注射后24小时处死小鼠取其背根神经,采用WB和免疫荧光的方法观察CalX对MAG的影响.结果:①与aCSF组对比,LPA注射后24小时MAG显著降低,持续到第3天,第7天降低不明显;②与aCSF组和aCSF+CalX组对比,LPA组在术后1~7天有明显的热痛敏和机械痛敏;与LPA组对比,CalX+LPA组热痛敏和机械痛敏明显减轻;③与aCSF组和aCSF+LPA组对比,CalX+LPA组WB结果显示CalX能完全阻止LPA诱导DR中MAG的下调,免疫荧光和WB结果是一致的.结论:单次鞘内注射LPA可以诱导背根神经MAG的下调,且是通过钙蛋白酶激活介导的.
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腰骶部背根神经的脉冲射频对细胞因子的影响
目的 观察腰骶部背根神经的脉冲射频对细胞因子TNF-、IL-1和IL-6的影响.探讨脉冲射频可能的机制.方法 对18例保守治疗无效的神经根性腰腿痛患者,在影像学引导下进行穿刺定位行背根神经脉冲射频治疗,在行背根神经的脉冲射频前24h(T0),术毕后即时(T1),术毕后6 h(T2),术毕后24 h(T3),术毕后4 h(T4),术毕后72 h(T5),分别抽取肘静脉血测定TNF-a、IL-1和IL-6浓度并对患者进行活动时视觉模拟尺度评分(VAS)评分.结果 与行背根神经的脉冲射频前24h比较,术毕后6 h(T2),术毕后24 h(T3),术毕后48 h(T4),术毕后72 h(T5)的TNF-浓度逐渐下降(P＜0.05),与T0比较T3、T4、T5IL-1和IL-6的浓度明显降低.与T0比较T1、T2、T3、T4、T5,(VAS)明显改善(P＜0.05).结论 腰骶部背根神经脉冲射频通过降低细胞因子TNF-a、IL-1和IL-6的产生,对神经根性疼痛有治疗作用.
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实验性糖尿病早期大鼠背根神经节一氧化氮合酶基因表达的变化
目的:观察糖尿病早期(2周)大鼠背根神经节(DRG)中一氧化氮合酶(nNOS、iNOS、eNOS)的表达变化以及胰岛素对其的影响.方法:按60mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备胰岛素依赖性糖尿病大鼠模型(16只),造模成功后随机分成2组(模型组和治疗组),治疗组于造模成功后第2天开始给予胰岛素治疗,正常对照组(8只)与模型组予皮下注射同样体积的生理盐水.2周后取各组大鼠背根神经节,Trizol法提取总RNA,应用RT-PCR法测定3种NOS mRNA的表达.结果:在糖尿病早期大鼠DRG中,iNOS表达明显上调,胰岛素能有效逆转此变化.而nNOS和eNOS的表达无明显变化.结论:在早期糖尿病DRG中iNOS基因表达异常,可能与糖尿病外周神经病变的发生发展有关.
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感觉和运动神经源性雪旺细胞与神经元共培养神经生长因子mRNA的表达
临床上修复神经缺损使用自体神经移植体时，神经感觉功能恢复较运动功能好，这可能与移植神经取自感觉神经有关，这种神经特异性再生的机制目前认为有多种机制参与［1］，而神经损伤后初雪旺细胞是远段神经的唯一成分，而且雪旺细胞被证实可以分泌包括神经生长因子(NGF)在内的多种神经营养因子［2］，因此我们以感觉和运动神经来源的雪旺细胞为研究对象，以NGF为指标，研究两种雪旺细胞与神经元共培养后NGF mRNA的表达是否有差异，探讨这种差异对神经特异性再生的作用。 一、材料和方法 1.雪旺细胞和神经元的体外培养：感觉性和运动性雪旺细胞、感觉和运动神经元的体外共培养参考文献［3，4］的方法。简要步骤如下：无菌条件下，分别取5 d龄SD乳鼠的背根神经(感觉性雪旺细胞)和股神经肌支(运动性雪旺细胞)，14 d龄SD胚鼠背根神经节(感觉神经元)和脊髓前角(运动神经元)，剪碎成糊状；分别置入离心管中，加入0.125%胰蛋白酶+0.03%Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)，消化30～40 min；1 500 r/min离心5 min；用DMEM/F12(Gibco公司)培养基将沉淀混悬成悬液，接种到培养皿中；37 ℃，体积分数为5%CO2细胞培养箱中孵育；雪旺细胞在48 h添加阿糖胞苷(5×10 -8 μg/L)，抑制成纤维细胞，第4天按1×109个/L的密度传代接种到6孔培养板盖玻片上，2 d后接种原代培养神经元细胞，这样就获得感觉性雪旺细胞和感觉神经元、运动性雪旺细胞和运动神经元的共培养。 2.共培养细胞NGF mRNA的表达：NGF mRNA表达的检测采用武汉博士德公司原位杂交检测试剂盒(MK1032型)提供的方法进行。简要步骤如下(以下溶液中均含有0.1%焦炭酸二乙酯)： 4%多聚甲醛固定液30 min；磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤3次；甲醇(含体积分数为0.03%过氧化氢)30 min；PBS洗涤3次；灭菌水洗涤3次；蛋白酶K，37 ℃，10 min；灭菌水洗涤3次；地高辛标记的cDNA探针和无关序列在杂交液内首先经过100 ℃，8 min的变性处理，然后置于碎冰中3 min，滴加到盖玻片上，上面覆以专用盖片(Sigma公司)；37 ℃孵育20 h；2 5 ℃的2×SSC(氯化钠17.4 g，柠檬酸钠8.8 g溶于1 000 ml水中)洗涤2次；37 ℃的0.1 ×SSC洗涤1次；加入封闭液，不洗；加入抗地高辛抗体，34 ℃孵育30 min；TBS(氯化钠30 g，三羟甲基氨基甲烷1.2 g，纯乙酸0.5 ml溶于1 000 ml水中)洗涤；加入酶标二抗， 34 ℃孵育20 min；TBS洗涤；加入显色液，34 ℃显色30 min；灭菌水洗涤，中止反应。显微镜下观察、比较。 二、结果 感觉和运动雪旺细胞与相应神经元混合培养后，第3天分别进行NGF mRNA原位杂交，图1为运动性雪旺细胞NGF mRNA表达染色，图2为感觉性雪旺细胞的表达，图3为空白对照，图中黑褐色染色颗粒的多寡即代表NGF mRNA表达量的多少。由图中可见，感觉性雪旺细胞NG F mRNA的表达颗粒明显较运动性雪旺细胞密集，而运动性雪旺细胞的表达接近于空白对照。
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脉冲射频治疗腰骶部神经根性疼痛的疗效观察
目的观察腰骶部背根神经脉冲射频治疗神经根性腰腿痛的临床疗效.方法回顾性研究了68例经保守治疗无效的神经根性腰腿痛病人,在影像学引导下进行穿刺定位,再行背根神经脉冲射频治疗.在病人治疗前及治疗后2个月进行活动时视觉模拟尺度评分(VAS).结果随访2个月后活动时VAS改善≥75%者20例(29.4%);VAS改善≥50%～70%29例(42.6%);VAS改善＜50%19例(28.0%).脉冲射频治疗后无严重并发症发生.结论腰骶部背根神经脉冲射频对神经根性疼痛有治疗作用.
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间断鞘内注射罗哌卡因和布比卡因对大鼠后肢感觉、运动功能的影响
目的 探讨间断鞘内注射不同浓度罗哌卡因、布比卡因后大鼠后肢感觉、运动功能及脊髓背根神经细胞的变化.方法 SD大鼠30只,采用随机数字表法分为5组(n=6).按改良法于L3-4蛛网膜下腔置管.分别经导管注入0.75%罗哌卡因(R1组)、1%罗哌卡因(R2组)、2%罗哌卡因(R3组)和2%布比卡因(B组)40μL,对照组(N组)注入人工脑脊液40μL,每1.5小时一次,共3次.于注药后1 d开始对5组大鼠进行热板仪、压痛仪及后肢撑力实验.以评价5组大鼠的感觉、运动功能.结果 N、R1、R2组感觉、运动功能及脊髓背根神经节病理学结果基本正常;R3组出现暂时性感觉异常,且神经元有轻度改变;B组出现暂时性肌力下降和不可逆性感觉异常,神经元表现为空泡形成、变性.结论 大鼠蛛网膜下腔间断注射浓度低于2%的罗哌卡因对脊神经无永久性损伤.而注射2%罗哌卡因和2%布比卡因均可造成大鼠后肢神经毒性损伤.且后者损伤程度大于前者.
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溶血磷脂酸对背根神经髓鞘相关基因Mag和髓鞘形成负性调节转录因子c-Jun表达的影响
目的 探讨单次鞘内注射溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对背根神经(dorsal root,DR)髓鞘相关基因Mag和髓鞘形成的负性调节转录因子c-Jun表达的影响以及其作用机制.方法 实验1:鞘内注射LPA(1 nmol),在不同的时间点(1h、3h、1d、2d、3d、7d、14d)行髓鞘相关基因Mag的实时荧光定量PCR(Real-time PCR).实验2:鞘内注射LPA(1 nmol),在不同的时间点(1h、3h、6h、24h、3d、5d)行c-Jun、p-c-Jun的Western blot.实验3:预先30 min给予JNK抑制剂SP600125(0.5 μ.g)鞘内注射,再给LPA(1 nmol)鞘内注射,在不同的时间点(20、40、60、120、180 min)行c-Jun的Western blot.结果 (1)给予LPA后1h髓鞘相关基因Mag的mRNA水平明显的降低,一直持续到注射后第7天,但第14天时不明显.(2)给予LPA(1 nmol)鞘内注射之后1h,c-Jun明显升高,一直持续到第3天,但第5天不明显;p-c-Jun也在加LPA后1h明显升高,但只持续到6h,24h不明显.(3)预先30 min给JNK抑制剂SP600125后,不能抑制DR c-Jun的升高.结论 在给予LPA之后DR髓鞘相关基因Mag是下调的;在给予LPA之后髓鞘形成的负性调节转录因子c-Jun和p-c-Jun都是升高的,但c-Jun不是通过经典的JNK-c-Jun通路发挥作用.
