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人TNF-α文献资料
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抗人TNF-α单抗基因的克隆及鉴定
目的 克隆抗人TNF-α鼠单抗得可变区基因以构建人-鼠嵌合抗体表达载体.方法 采用RT-PCR技术,以前导肽序列的引物从1个分泌抗人TNF-α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因(Vκ, VH),在大肠杆菌中表达Fab段核实其功能活性.结果 分别得到了2个Vκ和2个VH基因.DNA序列测定表明,其中1个轻链可变区基因为骨髓瘤细胞系中固有的无功能基因.1个重链可变区基因经原核系统表达测活表明无抗体活性.另一个轻链和重链可变区基因的成熟蛋白编码部分与从第一骨架区引物所克隆的、可在大肠杆菌表达出抗体活性的Vκ、VH序列相符.将该轻链、重链基因分别克隆到了人-鼠嵌合轻链、重链表达载体中.结论 通过原核表达系统核实,获得了抗TNF-α单抗的可变区基因.
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小鼠抗人TNF-α Fab基因的定点突变及其在大肠杆菌中的表达
目的: 对小鼠抗人TNF-α Fab基因进行人源化改造, 并获得人源化Fab段的可溶性表达产物.方法: 应用一步反向PCR法, 分别对小鼠VH、VL基因进行定点突变.将突变基因克隆入载体pComb3H并诱导表达.结果: 成功地将鼠抗VH 88位Ser突变为Ala, VL 17位Glu和18位Lys分别突变为Asp和Arg.成功地构建了人源化Fab的可溶性表达质粒, 并用Western-blot检测到其在上清液中有表达.结论: 得到人源化Fab的可溶性表达产物, 为进一步对其进行活性研究与纯品制备奠定了基础.
