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血管内皮生长因子及其受体2与被动致敏的人气道平滑肌细胞增殖相关性研究
目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)及其受体2(KDR)在被动致敏的人气道平滑肌细胞(ASMC)中表达变化及其对ASMC增殖的影响.方法 培养人ASMC,用支气管哮喘病人血清被动致敏ASMC.用免疫组织化学技术检测ASMC增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,MTT法检测细胞代谢活性及流式细胞仪分析细胞周期;用RT-PCR及Western blot方法分别检测VEGF和KDR mRNA及蛋白质在不同组人ASMC的表达程度.结果 (1)被动致敏组ASMC较对照组和干预组增殖显著增加(P＜0.05).(2)被动致敏组ASMC的VEGF121、VEGF165和VEGF189的mRNA表达分别较对照组和干预组显著增加(P＜0.05或P＜0.01).(3)被动致敏组ASMC VEGF及KDR蛋白质的表达较对照组和干预组显著增加(P＜0.05).直线相关性分析显示,ASMC中PCNA表达与ASMC中VEGF121、165、189及KDR mRNA表达水平呈正相关(r分别为0.73、0.82、0.77、0.70,P＜0.05);ASMC中PCNA表达与ASMC中VEGF及KDR蛋白质表达水平也呈正相关(r分别为0.69、0.67,P＜0.05).结论 被动致敏的ASMC中VEGF及其受体KDR表达上调,并与ASMC增殖密切相关.该结果提示VEGF及其受体2可能参与了哮喘气道重建中ASMC增殖的过程.
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一氧化氮对被动致敏人气道平滑肌细胞钾通道的作用
一氧化氮(NO)是一种重要的细胞信号分子,参与多种病理生理过程.既往动物实验发现硝普钠 (SNP)能通过开放钾通道松弛大鼠气道平滑肌,并且在单细胞水平上SNP(NO的供体)能使支气管哮喘(简称哮喘)大鼠模型的气道平滑肌细胞的大电导依赖性钾通道(BKCa)和电压依赖性钾通道(Kv)开放[1],但一氧化氮对哮喘患者的气道平滑肌细胞(HASMC)钾通道作用尚不十分清楚.我们采用全细胞膜片钳技术,通过哮喘患者血清致敏培养的人气道平滑肌细胞,观察SNP对BKCa和Kv电流及细胞兴奋性的影响.
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细胞周期蛋白D1对被动致敏的人气道平滑肌细胞增殖调控的影响
支气管哮喘(以下简称哮喘)的本质是气道慢性炎症,并在此基础上出现气道高反应性和气道重塑;而气道平滑肌增殖在哮喘气道重塑中起重要作用,是不可逆性气流阻塞、持续气道高反应性的重要病理基础.细胞分裂增殖必须经过细胞周期有规律地运行,细胞周期蛋白对细胞周期运行起关键的调控作用.已有研究证实,在人气道平滑肌细胞(HASMC),细胞周期蛋白D1表达增加可促进细胞增殖[1],但有关细胞周期蛋白D1对哮喘HASMC增殖调控的研究目前少见报道.由于哮喘患者的气道平滑肌很难获得,本实验用哮喘血清被动致敏的HASMC[2],观察细胞周期蛋白D1对HASMC增殖的影响,进一步阐明哮喘HASMC的增殖机制.
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延迟整流钾通道对哮喘患者血清被动致敏的人支气管平滑肌的张力调控
目的:探讨延迟整流钾通道(Kv)在哮喘患者血清被动致敏的人支气管平滑肌(HBSM)张力调控中的作用.方法:采用等长张力测定法,观察Kv通道阻断剂对正常与哮喘患者血清被动致敏的HBSM静息和收缩张力的影响.结果:①哮喘患者血清被动致敏的HBSM对组胺诱发的收缩反应明显强于对照组.②Kv阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)可引起静息状态下两组HBSM产生浓度依赖性收缩反应,且致敏组对4-AP所致收缩的敏感性强于对照组,即量效曲线中被动致敏组达到大效应的一半时所需浓度的负对数值(PD2)明显升高;但两组的大收缩强度(Emax)无明显差异;KCa阻断剂四乙基铵(TEA)和KATP阻断剂格列苯脲(Glib)对HBSM静息张力无明显影响.③4-AP预处理标本后,可明显增加对照组支气管环对组胺的收缩反应,即处理后Emax明显高于处理前;但不影响致敏组对组胺的收缩反应,即致敏组4-AP处理前后Emax无明显差异.结论:①Kv参与HBSM静息张力的调控,而KCa、KATP对其无明显影响.②哮喘患者血清被动致敏的HBSM的Kv活性下降,此变化可能是哮喘形成和发病的机制之一.
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TOLL样受体4对被动致敏人气道平滑肌细胞增殖及合成分泌TGF-β1功能的影响
目的:探讨TLR4的激活对哮喘血清被动致敏人气道平滑肌细胞(HASMCs)增殖与合成分泌功能的影响.方法:通过培养原代HASMCs,以人哮喘血清致敏细胞,观察HASMCs表面TLR4的表达、细胞增殖反应与转化生子因子-β1 (TGF-β1)在哮喘状态下的合成分泌水平.结果:与正常对照组相比,被动致敏组和TNF-α组HASMCs TLR4表达均显著增多(P＜0.01),增殖反应显著增强(P＜0.01),总蛋白浓度、IgE与TGF-β1的分泌水平均显著增高(P＜0.01),并且TNF-α组各项指标均较被动致敏组效果更加显著；抗TLR4抗体组各项指标较被动致敏组、TNF-α组显著减弱或减少(P＜0.01).结论:哮喘血清被动致敏HASMCs表面TLR4的活化可能通过诱导细胞的增殖和TGF-β1的合成分泌,导致哮喘气道微环境的改变,参与哮喘气道重构过程.
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钾通道在一氧化氮诱导的哮喘患者血清被动致敏的人气道平滑肌舒张中的作用
目的:探讨大电导钙依赖性钾通道(BKCa)、电压门控钾通道(Kv)和ATP敏感性钾通道(KATP)在一氧化氮(NO)诱发正常及哮喘血清被动致敏人气道平滑肌(HASM)张力变化中的作用.方法:应用等长张力记录方法,以钾通道阻断剂为工具药,观察NO及联合钾通道阻断剂对正常人及哮喘血清被动致敏的HASM环收缩张力的影响.结果:(1)在正常组和哮喘血清被动致敏组中,Kv的阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)可浓度依赖性地增加组胺(0.1 mmol/L)引起的收缩反应,4-AP(1、5、10mmol/L)可显著提高组胺的收缩张力(P< 0.05),而 KATP的阻断剂格列苯脲(Glib)(10 mmol/L)、BKCa的阻断剂四乙铵(TEA)(1 mmol/L)对组胺引起的收缩反应无明显影响.被动致敏组中组胺的大张力明显高于正常组(P< 0.05).(2)NO供体硝普钠(SNP)对正常人及哮喘血清被动致敏的HASM都有舒张作用,其对被动致敏组的舒张作用[(29.4±3.3)%]明显低于正常组 [(44.1±10.2)%],两组比较差异有显著性(P<0.05).(3)Glib对SNP(0.1mmol/L)的舒张作用无影响,4-AP(10mmol/L)对SNP的舒张效应有明显抑制作用(P<0.01).TEA(1mmol/L)可明显抑制SNP的舒张作用(P<0.05),并且在哮喘血清被动致敏组的抑制作用显著低于正常组(P<0.05).结论:NO供体SNP部分通过BKCa通道开放舒张HASM,在体外被动致敏状态下,该舒张效应减弱可能与BKCa通道活性下调有关.
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血管紧张素Ⅱ诱导被动致敏人气道平滑肌细胞合成Ⅰ型胶原
目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及其Ⅰ型受体(Angiotensin Type 1 Receptor,AT1R)拮抗剂洛沙坦(Losartan)对被动致敏人气道平滑肌细胞(human airway smooth muscle cells,HASMCs)合成Ⅰ型胶原的影响.方法 体外培养HASMCs,按处理因素将细胞分为4组:①被动致敏组(10％哮喘血清)；②被动致敏+AngⅡ组(10％哮喘血清+10-7mol/LAngⅡ)；③被动致敏+ Losartan组(10％哮喘血清+10-6mol/L Losartan)；④被动致敏+AngⅡ+Losartan组(10％哮喘血清+ 10-7mol/L AngⅡ+10-6mol/L Losartan).免疫荧光染色法鉴定HASMCs,荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原mRNA表达,ELISA检测Ⅰ型胶原蛋白分泌.结果 10-7 mol/l AngⅡ作用于被动致敏的HASMCs 24 h后,Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较被动致敏组明显增加(P＜0.01).在Losartan存在的情况下,AngⅡ对被动致敏HASMCs Ⅰ型胶原mRNA及蛋白表达的促进作用明显受到抑制(P＜0.01).结论 AngⅡ能促进被动致敏的HASMCs分泌Ⅰ型胶原,可能是通过与AT1R结合而实现的.
