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HIV-1相关炎性细胞因子诱导人血管内皮细胞中潜伏感染KSHV的溶解性周期复制
目的研究HIV-1感染相关炎症细胞因子是否能够激活人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中潜伏感染的卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV);探讨该激活作用是否由KSHV Rta基因所介导.方法采用体外模拟系统,研究了与HIV-1感染T细胞诱生的细胞因子相似的重组人细胞因子对HUVEC中潜伏感染的KSHV复制的影响.通过Northern blot和定量PCR检测ORF26(该基因编码的病毒次要衣壳蛋白仅在KSHV被激活时表达) mRNA表达来分析KSHV的激活.运用KSHV Rta基因启动子(KSHV复制时先被激活的启动子)驱动的虫荧光素酶报告基因进一步证实并扩展研究结果.结果包括干扰素-γ(IFN-γ)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)及制瘤蛋白M(oncostatin M, OSM)在内的重组细胞因子不仅可诱导HUVEC中潜伏感染的KSHV发生溶解性周期复制,而且能增强Rta启动子活性.结论 HIV-1感染相关的炎性细胞因子是诱导HUVEC中KSHV溶解性周期复制的因素,而且该过程至少有部分由KSHV的Rta启动子介导.
关键词： 细胞因子 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 复制和转录激活蛋白 -
重组慢病毒载体介导KSHV分子开关蛋白Rta在BCBL-1细胞中的表达及其功能鉴定
目的:构建含卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)分子开关蛋白,即复制和转录激活蛋白(replication and transcriptional activator,Rta)基因的重组慢病毒载体.方法:从真核表达质粒pcDNA3.1-Rta 中扩增出Rta基因,插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中,构建重组慢病毒载体pHAGE-Rta.将重组慢病毒骨架质粒pHAGE-Rta与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293 T细胞,通过荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的293 T细胞占总数的百分比.收集病毒悬液,采用梯度稀释法测定病毒滴度.以不同感染复数(MOI)的Lentivirus-Rta 病毒量感染BCBL-1细胞,72 h后检测Rta基因的表达,同时通过蛋白质印迹和病毒颗粒释放实验检测KSHV裂解期蛋白病毒白细胞介素-6(vIL-6)的表达及子代病毒颗粒的产出.结果:从真核表达质粒pcDNA3.1-Rta中扩增出Rta 基因,插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen后,酶切鉴定和核酸序列测定证实重组慢病毒骨架质粒pHAGE-Rta构建成功.通过慢病毒包装3质粒表达系统获得了表达Rta基因的重组慢病毒,滴度约为2×107 efu/mL.以不同MOI的重组慢病毒感染BCBL-1细胞,72 h后可检测到外源基因编码Rta蛋白的表达,且其表达能够上调KSHV vIL-6的表达水平及促进子代病毒颗粒的释放.结论:成功构建了含Rta基因的慢病毒表达载体,获得的重组病毒能够有效地感染BCBL-1细胞,并发挥激活KSHV裂解期复制的生物学功能.
