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幽门螺杆菌尿素酶B亚单位H-2d限制性TH表位的预测与鉴定
目的鉴定幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的H-2d限制性TH表位,为研究Hp表位疫苗奠定实验基础.方法用RANKPEP软件预测尿素酶B亚单位可能的H-2d限制性TH细胞表位,合成表位肽,采用淋巴细胞增殖试验、流式细胞分析及CD4+T淋巴细胞增殖试验进行表位鉴定.结果经软件预测获得7条可能的H-2d限制性TH细胞表位,多肽合成经分析各表位肽纯度均＞85%,其中3条表位肽U546-561、U229-244、U237-251能够刺激rUreB致敏的BALB/c(H-2d)小鼠的CD4+T淋巴细胞增殖(SI＞2).结论U546-561、U229-244、U237-251是UreB的H-2d限制性TH细胞表位,可进一步用于Hp表位疫苗的研究.
关键词： 幽门螺杆菌 尿素酶B亚单位 TH表位 BALB/c(H-2d)小鼠 -
核小体Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建
目的 将核小体Th表位与CTLA4Ig融合基因融合,研究CTLA4Ig作为真核表达载体的可行性.方法 用touchdown PCR法扩增CTLA4Ig基因,同时引入核小体Th表位(H2B14-28).将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1(+)-CTLA4Ih-H2B.将表达质粒转染COS-7细胞,Western blot检测转染细胞裂解上清中融合蛋白的表达.将构建表达CTLA4Ig-H2B的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207喂饲BALB/c小鼠,取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达.结果 酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功.在pcDNA3.1(+)-CTLA4Ig-H2B质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA4Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合.重组蛋白在BALB/c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达.结论 成功构建了能稳定表达核小体Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体.
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幽门螺杆菌尿素酶B亚单位Th表位的免疫学特性研究
采用MHC限制性分析、ELISA方法、淋巴细胞增殖实验等方法研究幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的H-2d限制性Th表位U546-561、U229-244、U237-251的免疫学特性.发现抗I-Ed抗体能够抑制U546-561对CD4+ T淋巴细胞的刺激,抗I-Ad抗体能够抑制U229-244、U237-251对CD4+T淋巴细胞的刺激作用.U546-561、U229-244能刺激CD4+ T淋巴细胞分泌IL-4和IL-10,U237-251刺激CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2,且U546-561、U229-244、U237-251三个表位肽免疫BALB/c小鼠能够引起针对各自免疫多肽和rUreB的CD4+T细胞应答.结果表明U546-561为I-Ed限制性Th2表位,U229-244为I-Ad限制性Th2表位、U237-251为I-Ad限制性Th1表位.三个表位之间具有协同刺激效应,可以用于Hp表位疫苗的研究.
关键词： 幽门螺杆菌 尿素酶B亚单位 TH表位 BALB/c(H-2d)小鼠 -
小鼠I-AκⅡ类分子限制性MAGE-3T表位筛选
为了筛选小鼠MAGE-3抗原来源的MHC Ⅱ类分子限制性多肽表位.用计算机模拟设计,从MAGE-3中选取得分高的5个候选表位.根据诱导T淋巴细胞增殖能力、对肿瘤细胞的特异性识别及释放细胞因子能力评价多肽的免疫原性及免疫反应性.结果DC负载MAGE-3 22-36能够强效诱导T淋巴细胞增殖,DC负载MAGE-3 22-36诱导的T细胞以MHC Ⅱ类分子限制性方式、特异性识别表达MAGE-3抗原的肿瘤细胞.DC负载MAGE-3 22-36诱导的T细胞群主要为CD4+Th1细胞,同时天然免疫系统中的NK、NKT、γ/δ T细胞也得到活化.从小鼠MAGE-3抗原中筛选出MHC Ⅱ类分子限制性多肽表位MAGE-322-36.
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表达核小体Th表位减毒鼠伤寒沙门菌株的构建
目的:构建表达核小体Th表位(H2B14-28)的口服减毒鼠伤寒沙门菌株.方法:将H2B14-28基因插入原核表达载体pYA3149中,构建重组质粒pH2B(pYA3149-H2B14-28)后,转入鼠沙门菌株X4550,斑点印迹鉴定表位肽的表达.观察X4550(pH2B)体内外携带重组质粒的稳定性.结果:酶切鉴定和基因测序显示pH2B构建成功.斑点印迹证实表位肽的表达.重组菌株在体内、外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖.结论:成功构建了能稳定表达核小体Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株,为进一步直接应用减毒鼠伤寒沙门菌活菌苗在肠道内表达抗原诱导SLE免疫耐受奠定基础.
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HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位的预测与鉴定
目的:初步鉴定人乳头瘤病毒18型E7抗原HLA-DRB1*0301限制性辅助T淋巴细胞(T-Helper Cell)表位.方法:用SYFPEITHI软件预测HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位,候选表位分别命名为P1、P2、P3,以固相多肽合成技术合成,并运用HPLC进行纯化和质谱法(MS)鉴定.以密度梯度法分离HLA-DRB1*0301阳性健康人外周血单核细胞(PBMC),合成肽刺激PBMC,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测淋巴细胞增殖活性,流式细胞仪分析细胞表型.结果:多肽P1(HPV18 E780-94)在体外刺激PBMC后能够有效诱导CD4+T淋巴细胞增殖.结论:P1(HPV18 E780-94)可能为HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th细胞表位.
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HPV18E7抗原T细胞表位的鉴定及CD4+T淋巴细胞的免疫反应
目的 初步鉴定人乳头瘤病毒(HPV)18型E7抗原的辅助T淋巴细胞(Th)表位及CD4+T淋巴细胞的免疫反应.方法 以免疫磁珠进一步分离HLA-DRB1*0301阳性健康人外周血单核细胞(PBMC)中的CD4+T淋巴细胞,流式细胞仪鉴定细胞纯度,用之前实验中已获得的3个HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位刺激外周血CD4+T淋巴细胞,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测CD4+T淋巴细胞增殖活性.ELISA方法分析表位刺激CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子.结果 多肽P1(HPV18E780-94)在体外刺激CD4+T淋巴细胞后能够有效诱导CD4+T淋巴细胞增殖,P1组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),多肽P1 (HPV18 E780-94)刺激CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ,P1组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 P1(HPV18 E780-94)可能为HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位.
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异源性Th表位修饰的CTLA4-Ig-msBlys构建及融合蛋白表达
目的 构建异源性Th表位修饰的CTLA4-Ig-msBlys的原核表达质粒,并在E.coli BL21中诱导融合蛋白表达,初步检测蛋白特性.方法 采用PCR法从质粒pCMV-sBlys扩增sBlys片段,将与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)Th 表位重组后的msBlys连接CTLA4-Ig片段,克隆人pGEX-KG原核表达载体,用LB固体培养基抗生素筛选、酶切并经琼脂糖凝胶电泳鉴定;将质粒pGEX-KG-CTLA4-Ig-msBlys转入E.coli BL21菌株中,实现插人基因的融合表达,用SDS-PAGE 和Western blot检测表达产物.结果 pGEX-KG-CTLA4-Ig-msBlys构建正确且终转人E.coli BL21,得到融合蛋白的表达;CTLA4-Ig-msBlys融合蛋白在E.coli中获得表达,表达产物的相对分子质量同预期值一致.结论成功构建原核表达质粒pGEX-KG-CTLA4-Ig-msBlys,并在E.coli BL21表达CTLA4-Ig-msBlys融合蛋白,为下一步探讨Blys在自身免疫性疾病患者的治疗作用莫定了基础.
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幽门螺杆菌尿素酶B亚单位优势Th表位的系统筛选与鉴定
目的 筛选幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)中CD4+细胞优势应答表位,并确定其MHC限制性.方法 以重组UreB蛋白(rUreB)与弗氏佐剂联合皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,从小鼠脾脏中体外扩增UreB特异性T淋巴细胞,采用步移重叠合成肽法筛选CD4+T细胞优势应答表位,分析其MHC分子限制性.结果 18mer短肽筛选发现UreB403-420和UreB409-426可显著刺激UreB特异性CD4+T细胞产生IFN-γ.13mer短肽鉴定实验结果显示,UreB409-421可刺激产生与18mer短肽UreB403 420和UreB409-426等同的应答强度.同时抗体阻断实验表明,抗H-2d (I-A)单克隆抗体能有效阻断该表位的应答.结论 UreB403-420和UreB409-426为UreB抗原中的优势Th表位,其刺激免疫反应的核心位置为UreB409-421,且存在H-2d(I-A)限制性.
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表达pCDR1 Th表位减毒鼠伤寒沙门菌株的构建
目的构建表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株.方法全基因合成pCDR1两条核苷酸链,在C端加上6-His标签,退火互补后插入原核表达载体pYA3149中,构建重组质粒pR1,将该重组质粒转入鼠沙门菌终宿主菌株X4550,获得杂合菌株X4550(pR1).体外诱导表达后斑点印迹鉴定表位肽的表达.结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功.体外诱导后6 h细菌裂解上清液中,检测到表位肽的表达,该蛋白能与鼠抗His单克隆抗体特异结合.重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖.结论成功构建了能稳定表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株.
