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PCV2-ORF2去信号肽基因的克隆与原核表达及对小鼠免疫效力的评价
目的 通过基因工程的方法表达猪圆环病毒2型的ORF2蛋白,并对表达蛋白进行小鼠免疫效力评价,为猪圆环病毒病疫苗的研制提供技术支持.方法 根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物.从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的死亡仔猪病料中提取基因组DNA,用PCR方法扩增出ORF2去信号肽基因,将该基因克隆至原核表达载体pET32α,获得重组质粒,经PCR、酶切以及序列分析鉴定,表明插入的片段为目的基因,插入的位置、大小和阅读框均正确,成功构建了重组质粒pet32α-ORF2,阳性重组质粒转化大肠杆菌Blgold(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达的佳条件,表达产物经纯化后,以每只小鼠0.2mg免疫5周龄的雌性小鼠,然后用ELISA检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况.结果 纯化的重组蛋白能使小鼠产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第7d开始产生抗体,第28d抗体水平达到高,抗体可维持7周以上,并具有良好的安全性.结论 表达目的蛋白能在小鼠体内产生特异性抗体,为进一步研究猪圆环病毒亚单位疫苗奠定了基础.
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非洲绿猴肾细胞中猪圆环病毒1型的检测
目的 建立轮状病毒疫苗污染事件中的外源因子猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1,PCV1)感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)的检测方法.方法 培养感染PCV1的Vero细胞6d后,通过定性PCR、定量PCR、电子显微镜(电镜)检查和原位杂交检测PCV1的复制与增殖.结果 从感染PCV1的Vero细胞培养物提取的DNA,其PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳可见特异性条带;定量PCR检测显示,感染6d后病毒总拷贝数是感染前的794.3倍;定性和定量PCR的低检出浓度均为102.0拷贝/ml;电镜观察到PCV1特征性形态病毒颗粒;原位杂交检测到出现深色阳性信号的PCV1阳性细胞.结论 PCV1感染Vero细胞后的复制增殖可以通过上述方法进行检测.
