您当前的位置：
首页 > 文献资料
所属专业：
凝血因子WE文献资料
-
B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达
本研究目的是构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒栽体,观察其在293T细胞中的表达情况.用限制性内切酶法获得B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因(BDDhFⅧcDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208,构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ;用限制性内切酶法鉴定载体的连接方向,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒pXZ208-BDDhFⅧ分别与包装质粒ANRF、包膜蛋白质粒VSV-G共转染293T包装细胞,包装后感染293T细胞,并以pXZ171作为对照.在感染后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDDhFVE基因的转录,一期法检测细胞培养上清FⅧ的活性,流式细胞仪(FCM)检测载体的感染效率,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合.结果表明:成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,其基因转导染效率达到了59.57%.RT-PCR法能够检测到BDDhFⅧ转录的mRNA.感染后24、48、72小时检测到细胞上清中FⅧ活性(FⅧ:C)分别为12%、43%、87%.PCR法扩增出了534bp的特异性片段.结论:成功构建的慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染293T细胞并表达有活性的FWⅧ,提示基因治疗可应用于血友病A.
