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造血干细胞移植建立血小板整合素β3胞内段截短体转基因小鼠模型
本研究通过逆转录病毒感染整合素β3缺陷小鼠(β3-/-)骨髓造血干细胞再进行骨髓移植建立β3及其胞内段不同截短体的转基因小鼠模型,为进一步研究整合素β3胞内段在血小板双向信号转导途径中的作用提供基础.将整合素β3野生型、β3-△759(缺失R760 GT762氨基酸片段)和β3-△754(缺失T755 NITYRGT7622氨基酸片段)的cDNA分别克隆至带有GFP编码基因的MSCV MigR1逆转录病毒载体质粒中,用质粒转染BOSC23包装细胞株包装出带有β3全长及不同突变体的逆转录病毒,再感染β3-/-供体小鼠骨髓细胞,尾静脉注射移植入经致死剂量辐照的野生型C57BL/6小鼠体内,移植后6-8周流式细胞术检测GFP和β3的表达率以评估转基因效率.结果表明,成功建立了空载(Vector)、β3野生型和截短突变β3-△759、β3-△754等4种小鼠模型,血小板转基因成功的比率(即GFP阳性率)为18％-66％,转基因血小板β3表达可达到β3+/-水平.结论:利用逆转录病毒感染的造血干细胞移植建立血小板转基因小鼠模型是一种高通量快速有效的建立转基因小鼠模型的方法,这为进一步研究整合素β3胞内不同区段对血小板整合素信号转导途径的影响及体内对血小板进行基因操作和基因治疗奠定了基础.
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三维斑点追踪技术评价肥厚型心肌病MYBPC3基因截短突变患者左室收缩功能和同步性的早期改变
目的 应用三维斑点追踪(3D-STI)技术评价MYBPC3基因突变致肥厚型心肌病患者的左室收缩功能和同步性的早期改变.方法 利用靶向外显子捕获测序方法对274例HCM患者的96个与遗传性心肌病相关基因进行全部外显子扩增和高通量测序,确定相应基因型,同时对所有研究对象进行临床资料、常规二维超声及三维斑点追踪技术分析.结果 20例患者携带MYBPC3截短突变,19例患者携带MYBPC3错义突变;截短突变患者发病年龄较早,进行改良Mor-row术式的患者较多,且1例患者猝死;二维超声参数,两组间无统计学差异;三维应变截短突变患者左室纵向应变(GLS)与径向应变(GRS)减低明显,同步性参数纵向及径向应变达峰时间标准差和大差值(TLS-SD％、TRS-SD％、TLS-diff％、TRS-diff％)显著延长(P＜0.05).结论 3D-STI技术能够发现MYBPC3截短突变患者左室收缩功能和同步性早期改变,可为临床HCM危险分层和治疗评估提供参考依据.
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MYBPC3基因型-肥厚型心肌病表型关联分析
目的 探讨MYBPC3基因突变类型与肥厚型心肌病(HCM)患者临床表型及不良预后的关联.方法 使用panel二代测序,检测529例HCM患者和307例健康对照的8个肌小节HCM致病基因.根据携带MYBPC3突变情况,将MYBPC3突变阳性患者分为3组:仅携带1个MYBPC3错义突变(错义组)、仅携带1个MYBPC3无义或剪切位点突变(截短组)或携带至少1个MYBPC3突变的多突变患者(多突变组).比较3组患者间基线临床特征及临床结局的差异.结果 本研究总计在93例(17.6％)患者中检测到64种MYBPC3致病突变.与未检出 MYBPC3突变的患者相比,携带MYBPC3突变患者的家族史阳性的比例更高,左心室室壁厚度更大,出现异常Q波的患者比例更高.在携带MYBPC3突变患者中,多突变组年轻,左心室室壁厚度更大.在4.7±3.2年随访期间内,MYBPC3突变患者全因死亡风险显著高于未检出 MYBPC3突变患者(校正HR 2.00,95％CI l.06-3.79,P=0.033),心血管死亡风险存在增加趋势(校正HR l.80,95％ CI 0.91-3.55,P=0.091).在MYBPC3突变阳性患者中,多突变组的心血管死亡(校正后HR 30.4,95％ CI 3.01-301.12,P=0.004)和全因死亡(校正后HR 25.2,95％CI 4.07-156.00,P=0.001)均显著升高,而截短突变组的心血管死亡和全因死亡则未见显著增加.尤其是携带MYBPC3复合突变的8例患者,在随访期间6(75％)例发生心血管死亡.结论 MYBPC3截短突变与HCM不良预后不存在相关性.携带多个突变的MYBPC3突变携带者,尤其是MYBPC3复合突变患者不良预后风险显著增.
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重组截短型人角质细胞生长因子1在昆虫细胞中的表达
目的:探讨重组截短型人角质细胞生长因子1( rhKGF1D23)蛋白在昆虫细胞中表达的可行性,为rhKGF1D23蛋白的生产提供新的途径.方法:PCR法扩增昆虫偏爱密码子优化截短序列kgf1d23亚克隆到pFastbac载体.在辅助质粒的作用下,pF astBac-kgf1d23载体Tn7片段转座到Bacmid中mini-attTn7位点,得到穿梭载体Bacmid-kgf1d23,并通过脂质体法转染sf-9细胞得到杆状病毒P1.继续转染细胞扩增病毒并提高病毒滴度,蛋白表达分析从P3代病毒转染细胞开始,收集细胞超声裂解后进行纯化,MTT法检测纯化后目的蛋白生物活性.结果:昆虫偏好密码子改造的kgf1d23基因构建进转移载体pFastBac-kgf1d23和穿梭载体Bacmidkgf1d23载体中.SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在60 h后开始大量表达,优化的收获蛋白时间在84～96 h；利用肝素亲和层析和SP阳离子交换层析可以去除90％以上的杂蛋白.纯化的rhKGF1D23蛋白在0.3～25.0 μg·L-1时,随浓度的增加HaCat细胞的促有丝分裂能力增强,在25.0 μg·L-1时达到平台期.结论:重组截短型角质细胞生长因子rhKGF1D23蛋白在昆虫细胞中得到表达,保持其特有的肝素亲和特性,并具有免疫原性及细胞生物学活性.
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腺瘤性结肠息肉(APC)蛋白截短突变对MDCK细胞中细胞-基质和细胞-细胞间黏附的影响
目的 探讨腺瘤性结肠息肉(adenomatous polyposis coli,APC)蛋白截短突变对MDCK细胞中细胞-细胞和细胞-基质之间黏附的影响及机制.方法 应用细胞黏附测定实验检验MDCK-N2-APC及MDCK-GFP稳定表达株系的黏附率.相对于对照细胞MDCK-GFP,MDCK-N2-APC细胞为稳定突变株,表达APC蛋白N端449-781氨基酸片段.免疫荧光染色、荧光定量PCR及Western blot测定在细胞黏附过程中发挥重要作用的黏附分子(CD29、E-cadherin)的表达情况.结果 与对照细胞相比,N2细胞-基质之间黏附率增加,平均升高约180％,而细胞-细胞间黏附率约下降30％.在MDCK-N2-APC细胞中CD29的表达水平增加,E-cadherin的表达水平降低.结论 APC蛋白在细胞-基质及细胞-细胞间黏附中发挥重要作用.其截短突变片段N2可能通过改变CD29和E-cadherin等黏附分子的表达量来影响细胞黏附,进而影响细胞的侵袭和浸润.
关键词： 腺瘤性结肠息肉(APC)蛋白 细胞-基质黏附 细胞-细胞黏附 截短突变 -
戊型肝炎病毒ORF3及其截短突变体真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达
目的 构建戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)的开放阅读框3(open reading frame, ORF3)基因及其突变体真核表达载体,并在人肺癌细胞系A549中表达.方法 以PUC-HEV为模板,PCR扩增HEV ORF3及其突变体目的片段,插入到真核表达载体pcDNA3.1-Flag中,构建重组质粒pcDNA3.1-ORF3/Flag、pcDNA3.1-△D1-ORF3/Flag、pcDNA3.1-△D2-ORF3/Flag和pcDNA3.1-△P2-ORF3/Flag,并转染A549细胞,利用Western印迹法检测ORF3及其突变体编码蛋白的表达情况.结果 经双酶切和测序鉴定真核表达质粒pcDNA3.1-ORF3/Flag、pcDNA3.1-△D1-ORF3/Flag、pcDNA3.1-△D2-ORF3/Flag和pcDNA3.1-△P2-ORF3/Flag构建正确,在转染A549细胞24 h后,在蛋白水平可以检测到ORF3及其突变体编码蛋白.结论成功地构建了HEV ORF3及其突变体真核表达载体,并在A549细胞中成功表达,为后期研究HEV各ORFs组分功能及其致病机制奠定基础.
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Dravet综合征相关NaV1.1(F1237fsX1269)截短突变对钠通道膜蛋白表达和功能的影响
目的 研究Dravet综合征相关Ⅰ型电压依赖性钠通道(NaV 1.1)截短突变体F1237fsX1269蛋白在HEK293T细胞中总蛋白及膜蛋白的表达水平变化,探讨NaV 1.1截短突变的可能致病机制. 方法 以质粒pCMV-SCN1A-WT为模板,构建带有增强型黄色荧光蛋白(EYFP)融合表达的野生型与截短突变质粒(分别标记为pCMV-EYFP-SCN1A-WT、pCMV-EYFP-3710),并转染至HEK293T细胞,48 h后运用生物素标记方法提取总蛋白与膜蛋白,应用Western blotting检测野生型蛋白与截短突变蛋白的总蛋白及膜蛋白表达水平,应用全细胞膜片钳技术记录野生型蛋白与截短突变蛋白所产生的钠电流. 结果 Western blotting检测结果显示:pCMV-EYFP-3710质粒转染HEK293T细胞后可检测到相应截短突变蛋白,相对分子质量约为191 000,且均可在细胞胞浆及胞膜上表达.截短突变蛋白的总蛋白表达水平与野生型蛋白相比明显减少,膜蛋白表达水平只有野生型蛋白的43％,差异有统计学意义(P＜0.05).电生理检测结果显示:野生型蛋白可检测到正常钠离子电流[电流密度为(-149.0±7.7) pA/pF],而截短突变蛋白未检测到钠离子电流. 结论 Dravet综合征相关NaV1.1截短突变体F1237fsX1269产生的截短突变蛋白的膜蛋白表达水平降低,并丧失钠离子通道功能,其机制可能与野生型蛋白竞争β1、β2亚基而产生显性负效应有关.
关键词： Dravet综合征 SCN1A基因 Ⅰ型电压依赖性钠通道 截短突变 膜蛋白 -
黑斑息肉综合征一家系中STK11基因突变研究
目的 检测一个黑斑息肉综合征(PJS)家族的STK11基因突变类型.方法 从PJS患者外周血及息肉组织中提取基因组DNA;采用PCR分别扩增STK11基因的9个外显子及非编码区域;采用直接测序法检测DNA序列;采用Western blot检测息肉组织中突变STK11蛋白表达情况.结果 该家族中所有PJS患者在STK11基因第5个外显子21位密码子CAG突变为TAG,并编码截短了的STK11蛋白.结论 STK11基因第5个外显子21位密码子CAG突变为TAG是导致该家族PJS发病的原因,可作为该家族中预诊断PJS的指标,同时该突变也可能导致患者恶性肿瘤发生概率增加以及早期发病,提示PJS患者预后不良.
