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ICAM-1-GFP的构建及其与Molt-4细胞的结合
本研究构建人细胞间黏附分子1(ICAM-1)全长基因的真核表达载体pEGFP-Cl-ICAM-1,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)细胞株,并检测其在CHO细胞中的表达及与Molt-4细胞的结合.采用RT-PCR法从健康人外周血中分离单个核细胞,钓取ICAM-1全长基因(1622 bp),与pMD18-T载体连接做全自动序列测定.将测序正确的克隆质粒pMD18-T-ICAM-1和表达载体pEGFP-C1分别用HindⅢ和Ⅰ进行双酶切,应用基因重组技术构建ICAM-1全长基因真核表达载体pEGFP-Cl-ICAM-1,质粒经Hind Ⅲ和Sacll双酶切和PCR电泳鉴定后,采用脂质体转染法转染CHO细胞,并进行G418筛选.用RT-PCR、流式细胞术和荧光显微术检测ICAM-1-GFP的表达及亚细胞的定位,用检测ICAM-1-GFP/CHO细胞与Molt-4细胞的结合能力评价ICAM-1-GFP融合蛋白的功能.结果表明:重组质粒经限制性酶切鉴定得到与ICAM-1全长基因长度一致(1622 bp)的酶切产物;测序分析证实,PCR产物与GenBank上登录的ICAM-1基因(NM_000201)序列完全一致,表明成功地完成了ICAM-1的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的CHO细胞有绿色荧光蛋白的表达,表达的融合蛋白较均匀地分布于整个细胞:FACS检测ICAM-1-GFP的荧光转染率为(13±5.5)%,表明ICAM-1-GFP基因进入到CHO细胞并获得了有效表达,成功构建了ICAM-1-GFP/CHO细胞,并且ICAM-1-GFP/CHO细胞能够结合PMA处理的Molt-4细胞.结论:成功构建了ICAM-1-GFP真核表达载体,构建的ICAM-1-GFP真核表达载体在CHO细胞内稳定表达,ICAM-1-GFP/CHO细胞能与Molt-4细胞结合.这为进一步研究ICAM-1分子的功能打下基础.
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表达血小板膜糖蛋白GPIb-IX复合物的中国仓鼠卵巢细胞株研究模型的建立
本研究旨在建立表达重组野生型和突变型血小板膜糖蛋白GPIb-IX复合物的中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)细胞研究模型,为进行GPIb-IX生理功能的相关研究奠定基础.从表达野生型或缺失突变型GPIbα的大肠杆菌宿主菌中抽提质粒并用EcoR I酶切鉴定,然后将分别表达GPIbα、GPIbβ和GPIX 3种基因的质粒共转染到中国仓鼠卵巢细胞中,通过免疫共沉淀、Western blot和流式细胞仪检测其表达效果.结果表明,转粢48小时后,CHO细胞裂解物和细胞表面均可检测到GPIb-IX复合物的表达.结论:成功构建了表达血小板膜糖蛋白GPIb-IX复合物的CHO细胞研究模型.
关键词： 血小板膜糖蛋白 GPIb-IX复合物 CHO细胞株 -
LTβR-Ig融合蛋白的真核表达及其体外生物学功能的研究
目的 为了研究LTβR-Ig的生物学功能,构建重组的LTβR-Ig/pcDNA3.1(+)真核表达载体,在CHO细胞中表达,无血清扩大培养,并初步研究了融合蛋白LTβR-Ig的体外生物学活性.方法 将鼠LTβR胞外段cDNA与人IgG1 Fc段cDNA共同克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO-K细胞表达,阳性克隆进行无血清培养,采用PtoteinA亲和层析的方法进行纯化;3[H]TdR参入法检测对细胞增殖的影响.结果 经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序,结果表明克隆了正确序列的LTβR胞外段序列,成功构建了重组表达质粒LTβR-Ig/pcDNA3.1,并在CHO细胞中稳定表达了LTβR-Ig的融合蛋白,证明LTβR-Ig融合蛋白能抑制混合淋巴细胞反应.结论 本研究建立了能稳定表达有生物活性的LTβR-Ig融合蛋白的真核表达系统,为今后研究LTβR在移植排斥中的作用机制,及开展基因重组药物进行疾病的生物治疗奠定了基础.
关键词： 鼠LTβR 基因表达 CHO细胞株 LTβR-Ig融合蛋白 -
胰岛素样生长因子1稳定表达CHO细胞株的建立
目的 建立稳定的高效表达胰岛素样生长因子1(IGF-1)的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO),以便于大量生产纯化IGF-1蛋白.方法 采用脂质体将IGF-1的表达载体pSec-IGF-1导入CHO-K1细胞中.转染后用含潮霉素B(hygromycin B)的选择性培养液进行筛选,挑取耐药克隆,收集细胞培养上清,用Western blot法及ELISA法进行检测,并用免疫组化法对阳性克隆进行分析.结果 转染细胞在选择性培养液中生长出多个耐药克隆,Western blot检测示8个克隆表达上清出现与预计值相符的约7.7kDa的特异性条带;ELISA结果显示有2株表达量在2.0μg/ml以上;免疫组化检测,筛选到的阳性克隆细胞有IGF-1的表达.结论 建立了稳定的高效表达IGF-1的CHO细胞株.
关键词： 人胰岛素样生长因子1 基因转染 CHO细胞株
