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乙肝病毒PreS2基因在大肠埃希菌中的表达
目的 在大肠埃希菌( Escherichia coli )中表达乙肝病毒前S2(HBV PreS2)蛋白,并对其进行鉴定和纯化.方法 利用DNA重组技术,将全长的HBV PreS2基因克隆至pMAL-C2x[融合表达载体含麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)标签蛋白]质粒中,构建pMAL-C2/S2表达载体,转化至 E.coli ,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的 蛋白的表达形式,依据其不同的表达形式采取适当的纯化方案,纯化产物经Western blot和ELISA法检测反应原性,经Xa因子切割去除MBP标签蛋白.结果 成功构建了表达载体pMAL-C2/S2,目的 蛋白为PreS2-MBP,以包涵体和可溶性2种形式表达.纯化产物能与anti-Hepatitis B virus PreS2 Antigen发生特异性反应.融合蛋白经Xa因子切割去除了MBP标签蛋白.结论 在 E. coli 中成功表达了HBV PreS2蛋白,为进一步研制新型HBV预防及免疫治疗制剂打下了基础.
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preS2荧光融合蛋白的表达及其对人端粒酶逆转录酶启动子的激活作用
目的 探讨乙型肝炎病毒编码的preS2蛋白对人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子的激活作用.方法 PCR扩增人preS2基因,构建preS2与绿色荧光蛋白融合表达的载体pEGFP-preS2,共转染后通过荧光显微镜检测融合基因的表达.将pEGFP-preS2和hTERT全长启动子报告质粒pGL3B-TRTP共转染HepG2细胞,48 h后裂解细胞,双荧光检测分析preS2对hTERT启动子的激活作用.结果 荧光显微镜检测证实pEGFP-preS2可在体外有效表达preS2融合蛋白,双荧光试验表明preS2可显著激活hTERT启动子,此激活作用具有剂量依赖性.结论 成功构建preS2绿色荧光融合表达载体,并初步证实其对hTERT启动子的激活作用,为进一步探讨肝癌发生中hTERT表达调控机制奠定基础.
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毕赤酵母表达乙型肝炎病毒preS2S蛋白的纯化和免疫效果
目的 研究重组毕赤酵母表达的乙型肝炎病毒preS2S蛋白的纯化方法及免疫效果.方法 甲醇诱导含preS2S基因的重组毕赤酵母菌,采用蔗糖区带速率离心、Butyl-S-Sepharose 4FF疏水层析和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析等方法,对表达产物进行纯化.纯化后蛋白经SDS-PAGE和Western blot方法鉴定,制备成疫苗,并进行效力试验.放射免疫法检测免疫小鼠血清抗体浓度,计算ED50和相对效力.ELISA法检测血清中的preS2S抗体.结果 纯化后的preS2(epi)S蛋白相对分子质量约为27 000,且能与特异性抗体结合.两批纯化蛋白制备的疫苗ED50分别为0.35和0.48 μg/ml,参比苗为0.52 μg/ml.2批疫苗的体外相对效力分别为1.5和1.1,均合格,血清抗体平均浓度为808和784 mIU/ml,参比苗为312 mIU/ml.2批疫苗免疫小鼠后均产生了preS2抗体.结论 该纯化方法实用有效,纯化后的preS2(epi)S蛋白比S蛋白具有更好的免疫原性.
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乙肝前S蛋白检测的临床应用
[目的]探讨乙肝前S蛋白的临床应用价值.[方法]对186例HBsAg阳性标本进行PCR法检测HBV-DNA,并采用ELISA方法测定HBV血清标志物、PreS1蛋白、PreS2蛋白,将结果作比较.[结果]HBV-DNA(+)标本中,PreS1蛋白检出率为66.10%,PreS2蛋白检出率为91.53%;在HBeAg(+)标本中,PreS1蛋白检出率为72.73%,PreS2Ag检出率为96.1%,其检出率均明显高于HBV-DNA(-)组及HBeAb(+)组.[结论]前S蛋白与HBeAg、HBV-DNA显著相关,可作为HBV复制的新指标,能完善和补充乙肝病毒血清标志物的检测.
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乙型肝炎病毒外膜蛋白的分子生物学研究进展
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)外膜蛋白含PreS1、PreS2和S 3种蛋白,位于病毒颗粒的外表面,参与病毒颗粒的吸附、组装与成熟,在保护性免疫应答反应中起重要作用,HBV感染肝细胞所合成的外膜蛋白对肝细胞的生长、代谢,甚至是恶性转化产生一系列重要的生物学调节效应,外膜蛋白的变异使得HBV对受染肝细胞的影响非常复杂且成多样化,在病毒性乙型肝炎慢性化及其相关疾病演变过程的分子病理机制扮演重要角色.
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e抗原阴性慢性乙肝患者血清表面抗原大蛋白、PreS1蛋白、PreS2蛋白与HBV-DNA检测分析
目的:通过检测HBeAg阴性慢性乙肝患者血清表面抗原大蛋白(HBV-LP)、PreS1蛋白、PreS2蛋白和HBV-DNA比较分析,以探讨血清乙肝大蛋白检测对于HBeAg阴性慢性乙肝患者在临床诊治中的价值和意义.方法:采用ELISA法检测247例HBeAg阴性慢性乙肝患者HBV-LP、PreS1蛋白、PreS2蛋白,并应用实时荧光定量PCR技术平行检测HBV-DNA.结果:247例HBeAg阴性慢性乙肝患者HBV-DNA阳性率51.0%,血清HBV-LP阳性率66.4%,PreS1蛋白阳性率22.3%,PreS2蛋白阳性率34.0%,血清中HBV-LP阳性率明显高于PreS1蛋白和PreS2蛋白阳性率,差异均有显著性(P均<0.01).结论:HBeAg阴性慢性乙肝患者检测其血清HBV-LP较PreS1蛋白和PreS2蛋白更敏感反映体内HBV感染和复制状态,HBV-LP更有利于HBeAg阴性慢性乙肝患者的疗效观察和预后判断.
