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弓形虫侵入相关分子ROP1在HepG-2细胞中的表达
弓形虫棒状体蛋白1(ROP1)是与虫体侵入相关的重要分子.将含编码ROP1蛋白基因的真核表达重组质粒pcDNA3转染HepG-2细胞,为进一步研究做准备.用脂质体介导的真核细胞转染法,G418筛选阳性克隆,SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物.结果显示,在所筛选的克隆化生长的细胞裂解液样品电泳图谱中,有一大小约35～40 kDa的特异电泳条带,该条带可被弓形虫免疫兔血清识别.本研究建立了体外稳定表达ROP1的细胞系,证实了表达产物的免疫原性.
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表达弓形虫棒状体蛋白1的重组乳酸乳球菌诱导小鼠免疫应答的研究
目的 用表达弓形虫棒状体蛋白1(ROP1)的乳酸乳球菌口服免疫小鼠,观察其所诱导的体液免疫、黏膜体液免疫和保护力.方法 69只BALB/c小鼠随机分成疫苗免疫组、乳球菌对照组和生理盐水组,每次分别饲喂5×109个/鼠悬浮在缓冲液中的重组乳酸乳球菌、不含重组质粒的乳酸乳球菌及等体积的生理盐水.第27、34、48天分别从鼠尾静脉采血,分离血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IgG水平;第48天杀死3只小鼠,分离小肠黏液检测SIgA水平;第48天用弓形虫灌胃感染小鼠,观察小鼠发病情况,计算小鼠死亡率,30 d后统计小鼠肝、脑组织中的虫体数量.结果 疫苗免疫组小鼠IgG水平与乳球菌对照组、生理盐水组比较,差异均有统计学意义(P均＜0.01).疫苗免疫组小鼠SIgA水平与乳球菌对照组、生理盐水组比较,差异均有统计学意义(P均＜0.01).疫苗免疫组小鼠肝、脑组织中虫体数与乳球菌对照组、生理盐水组比较,差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 表达弓形虫ROP1蛋白的乳酸乳球菌可诱导小鼠体液免疫和黏膜体液免疫,但对弓形虫感染无保护力.
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含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅲ.免疫鼠肌组织表达产物免疫酶法定位及血清IgG抗体测定
目的用所构建的弓形虫pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒,经肌肉注射免疫小鼠,观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答.方法碱裂解法大量制备pcDNA3-ROP1质粒,免疫BALB/c小鼠,每只鼠注射100ug, 两周后同量加强免疫一次,以pcDNA3空质粒及生理盐水组为对照.于免疫后第50天用间接免疫酶法检测注射局部肌组织重组蛋白的表达;ELISA法测定IgG抗体滴度.结果免疫鼠肌组织石蜡切片呈特异性阳性反应;血清IgG抗体90天后测定为阳性;皮下及肌肉不同免疫途径血清均显示阳性结果,无显著性差异.结论 pcDNA3-ROP1质粒DNA免疫小鼠后,肌组织内有重组蛋白表达,并能诱导机体产生IgG抗体.
关键词： 弓形虫 棒状体蛋白1 pcDNA3-ROP1重组质粒 DNA免疫 免疫酶 -
含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用
目的构建IFN-γ基因真核表达重组质粒作为基因佐剂,观察其与pcDNA3-ROP1(pc-ROP1) DNA共同免疫小鼠所诱导的免疫应答.方法将IF N-γ基因片段定向插入真核表达载体pcDNA3,双酶切鉴定,获得pcIFN重组子;碱裂解法大量制备,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,每只鼠注射pcIFN、pc-ROP1各100μg,两周后同量加强免疫一次,以pcDNA3空质粒及生理盐水组为对照.分别于免疫后第30天、50天、70 天共三次用MTT法测定小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性及NK细胞活性;双夹心ELISA测定血清细胞因子IFN-γ、IL-2及酶法测定NO含量;ELISA法测定IgG抗体滴度.结果构建成功的作用下,该两项指标均明显提高,且IFN-γ、IL-2及NO水平均较不加佐剂组显著提高(P＜0.01);而对IgG抗体滴度无显著影响(P＞0.05).结论 IFN-γ基因佐剂具有协同pc-ROP1DNA免疫的作用,可增强免疫鼠细胞免疫应答,IFN-γ、IL-2细胞因子及NO的产生.
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弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建
目的构建弓形虫ZS2株pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒,为进一步表达及DNA免疫做准备.方法用PCR技术从弓形虫ZS2分离株的基因组DNA中扩增编码棒状体蛋白1 (ROP1)的基因片段,重组入pUC18克隆载体.将pUC18-ROP1中的ROP1外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3真核表达载体,再经含氨苄LB培养基筛选,酶切、PCR鉴定.结果从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的ROP1基因片段,克隆成功pUC18-ROP1;经亚克隆,筛选鉴定获得了pcDNA-ROP1重组质粒.结论构建成功弓形虫pUC18-ROP1重组质粒,亚克隆成功pcDNA-ROP1重组质粒,为下一步研究奠定了基础.
关键词： 弓形虫 棒状体蛋白1 克隆 pcDNA3-ROP1重组质粒
