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鼠伤寒沙门氏菌STM1697蛋白的原核表达及纯化
目的 原核表达并纯化沙门氏菌毒性相关蛋白STM1697,为其功能研究奠定基础.方法 以鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)基因组为模板,PCR扩增STM1697基因,双酶切后连接到原核表达载体pGL01中.将阳性重组子转化入大肠埃希菌BL21 (DE3)以IPTG诱导,表达产物经镍离子亲和柱进行纯化,并用SDS-PAGE分析鉴定蛋白及纯度.结果 成功将STM1697基因克隆到原核表达载体pGL01中.STM1697蛋白在大肠埃希菌BL21 (DE3)以可溶形式表达,经镍离子亲和柱纯化后得到的蛋白纯度＞95％.结论 伤寒沙门氏菌STM1697蛋白在大肠埃希菌中可稳定表达,为其功能研究奠定了基础.
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野生型和突变型乳腺癌标志基因C35蛋白的原核表达和纯化
目的 构建野生型和C112S突变型乳腺癌标志基因C35的原核表达载体,使其在原核细胞中高效表达、纯化并予以鉴定.方法 聚合酶链反应(PCR)法扩增野生型和突变型C35基因,将其分别插入原核表达载体pGLO1中,构建重组融合蛋白表达载体野生型pGLO1-C35和突变型pGLO 1-C35,转化大肠杆菌E.coli BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达C35融合蛋白,并对诱导条件进行优化,通过镍离子螯合亲和层析柱纯化野生型和突变型C35融合蛋白,经蛋白质印迹法验证纯化的重组蛋白特异性.结果 成功构建了野生型和突变型C35基因的原核表达质粒,并将两种C35融合蛋白成功表达,佳诱导表达条件为37℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导6h,经纯化后获得高纯度的特异性重组蛋白,浓度达约1.5 mg/mL.结论 在原核表达系统中成功表达、纯化了野生型和突变型C35融合蛋白,为进一步制备基于C35抗血清的乳腺癌早期筛查试剂盒奠定了基础.
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MERS冠状病毒核衣壳蛋白原核表达和纯化
目的 构建带有MERS-CoV N( MERS冠状病毒核衣壳蛋白)基因片段的pET-22b+原核表达载体,并表达和纯化核衣壳蛋白( NP). 方法 通过PCR技术扩增NP蛋白基因片段,插入到原核表达载体pET-22b+上. 使用核酸电泳、测序以及小量诱导表达确认所构建克隆的正确性,然后将重组质粒转化进大肠杆菌BL21a(DE3)中,并在大肠杆菌BL21a(DE3)中大规模诱导表达NP蛋白,使用AKTA纯化系统经强阳离子交换层析纯化出NP蛋白.结果 测序和小量诱导结果表明,扩增的NP蛋白片段序列正确,所构建的pET-22b+-NP克隆可在大肠杆菌BL21a (DE3)的包涵体和细胞质中表达;通过阳离子交换层析和浓缩后,蛋白的纯度和浓度都得到明显提高. 结论纯化出高纯度、高浓度的NP蛋白,为NP蛋白功能性研究提供重要基础.
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李斯特细菌hlyA的原核表达与纯化
目的 构建李斯特细菌毒力基因原核表达质粒,并诱导其表达纯化并鉴定目的蛋白.方法 构建李斯特溶血素O(Listeriolysin 0,LLO)的原核表达载体PGEX/3X,并利用Factor Xa切割了GST标签,酶切正确后构建重组原核表达质粒,并转化到大肠杆菌,IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blot鉴定.结果 目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因GenBank登陆的序列完全一致,重组质粒经IPTG诱导表达相对分子量为60 kD的目的蛋白;Western blot鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗LM抗体特异性结合.结论 成功构建了重组原核表达质粒,并纯化获得高纯度的LLO蛋白.
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重组可溶性人IL-6的原核表达纯化和活性鉴定
使用大肠杆菌BL21(DE3)重组表达可溶性人IL-6并对其进行纯化和活性鉴定.以入激活T细胞总RNA为模板,逆转录PCR扩增人IL-6的基因片段并将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件获得可溶性表达目的蛋白.细菌裂解上清经镍金属螯和层析纯化,SDS-PAGE鉴定其分子量大小,western blot鉴定其免疫原性,并通过IL6依赖的细胞株T1165分析重组蛋白的活性.成功构建了pET32a(+)/IL-6表达载体,并获得了可溶性表达的重组人IL-6蛋白.SDS-PAGE显示,其分子量约为21kD,可被抗IL-6抗体特异性识别,并且该重组蛋白可刺激IL-6依赖的细胞株T1165增殖,比活性与标准品一致,约为1×106 U/mg.本实验获得了可溶性高表达的重组人IL-6蛋白,为进一步研究人IL-6奠定了基础.
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人白介素24基因克隆表达、纯化及活性检测
目的 克隆人IL-24基因,构建原核表达栽体,表达纯化GST-IL-24融合蛋白,检测其活性.方法 用密执毒素诱导HeLa细胞表达IL-24 mRNA,通过RT-PcR获取IL-24 cDNA,将其克隆至原核表达裁体pGEX-4T-2,IPTG诱导表达,经GSTrapTM FF column亲合纯化,SDS-PAGE和Western blot检测融合蛋白的表达,MTT法检测GST-IL-24对宫颈癌CaSKi细胞的抑制作用.结果 克隆得到人IL-24的cDNA,序列与GenBank公布序列完全一致,SDS-PAGE电泳可见50 kD大小的融合蛋白表达.GST-IL-24以剂量依赖的方式抑制宫颈癌CasKi细胞的生长.结论 成功构建人IL-24基因原核表达载体,表达纯化得到GST-IL-24,该融合蛋白时宫颈癌CasKi细胞具有抑制作用.
