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γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因调控的初步研究
目的 研究抗氧化基因--大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的功能区及其调控表达.方法 克隆1.76 kb大鼠γ-GCS基因的重链亚单位--GCLC基因的上游调控序列,并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc (GCLC/pGL-3).利用嵌顿缺失方法构建GCLC基因的缺失体,并将其表达载体转染大鼠肺泡上皮细胞,在细胞中分析该基因的调控区域.通过该方法初步发现GCLC基因的上游调控序列的-745～-705 bp属负性调控区域.利用EMSA和supershift证实大鼠肺泡上皮细胞GCLC基因负调控区域的E-box元件能与转录因子USF1/USF2特异性的结合.将USF的真核表达载体和逆转录病毒表达载体分别导入肺泡上皮细胞,观察GCLC基因的转录活性和GCLC蛋白的表达情况.结果 GCLC基因的-403～-111 bp和-705～-613 bp区段属正调控区域;-745～-705 bp属负调控区域.EMS和supershift证实上游刺激因子(USF)能与该负调控区域的E-box元件结合抑制GCLC基因的转录和表达.结论 发现GCLC基因其中2个正调控区域(-403～-111 bp与-705～-613 bp)和1个负调控区域(-745～-705 bp), 其中负调控区域-745～-705 bp上的 E-box元件通过与USF结合介导GCLC基因的负性表达调控.
关键词： 慢性阻塞性肺病 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 氧化应激 E-box元件 大鼠 -
大鼠GCLC基因两个相邻E-box元件功能分析
目的 研究GCLC基因上游两个相邻E-box元件的作用及探讨E-box元件组合的基因转录抑制机制.方法 利用PCR定点缺失法构建单缺失E-box元件(-804～-799)以及双缺失E-box元件(-804～-799、-729～-724)含GCLC上游启动子序列的报告基因载体.将所构建的载体在脂质体介导下瞬时转染大鼠支气管上皮细胞(RTE)、大鼠肺泡上皮细胞(CCL-149),通过比较转染后细胞的荧光素酶活性分析E-box元件对GCLC基因转录活性的影响.结果 成功构建出定点缺失E-box元件的GCLC-Luc.在大鼠支气管上皮细胞和大鼠肺泡上皮细胞(CCL-149),转染GCLC-delhE-box-Luc组与GCLC-DdelE-box-Luc组荧光素酶值较转染GCLC-Luc组均明显升高(P均＜0.01),均与转染GCLC-delE-box-Luc组荧光素酶值水平大致相同.E-box元件(-804～-799,CACATG )在GCLC基因的基础状态下的转录表达中起抑制作用.结论 两个E-box元件可能以转录因子及元件复合物形式抑制GCLC基因的转录调控.
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E-box元件在p21基因表达调控中作用的研究
目的:通过p21基因调控序列E-box位点的突变分析,研究E-box位点对p21基因表达调控的作用.方法:将人野生型p21基因启动子全长序列构建到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic,并进一步对重组载体pGL3-p21p启动子E-box位点做定点突变,构建突变载体E1、E2、E3,分别转染人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304细胞),DLR系统测定荧光素酶活性,并观察E-box位点突变前后荧光素酶活性变化.结果:测序结果表明野生型pGL3-p21P及突变载体E1、E2、E3构建成功.野生型pGL3-p21p荧光素酶活性(105.82±16.55)明显高于空载体pGL3-basic(1.56±0.62);突变载体E1、E2、E3的荧光素酶活性(70.71±16.46,37.87±3.26、83.25±11.48)较野生型载体不同程度下降(P＜0.01).结论:p21基因启动子某些E-box位点参与了p21基因的表达调控.
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大鼠GCLC基因5'-上游调控区域(-876～+1)的3个E-box元件功能分析
目的:GCLC基因表达调控有助于在分子水平了解GSH变化的机制,对进一步探索机体抗氧化失衡的机制有重要意义.本实验主要研究GCLC基因上游调控区域(-876～+1)三个相邻E-box元件的作用及探讨E-box元件组合的基因转录作用机制.方法:利用PCR定点缺失法构建多种组合的缺失E-box元件的GCLC上游启动子序列的报告基因载体.将所构建的载体在脂质体介导下瞬时转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2细胞),通过比较转染后细胞的荧光素酶活性,分析E-box元件对GCLC基因转录活性的影响.结果:成功构建出多组定点缺失E-box元件的GCLC-Luc基因.在大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中转染缺失了E-box的GCLC-Luc组较转染GCLC-Luc组均有明显升高(P均＜0.05).结论:三个E-box元件(-804～-779,-729～-724,-590～-585)在GCLC基因的基础状态下的转录表达中都起到一定的抑制作用,可能以转录因子及元件复合物形式抑制GCLC基因的转录调控.此结果揭示GCLC基因上其他E-box元件之间也可能存在着相互作用方式,而非简单的单独作用.
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E-box元件对大鼠γ-GCS催化亚单位基因调控作用的组织特异性研究
目的:探讨大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位 (GCLC)基因启动子 (-745～-705) 区段E-box元件对其转录调控是否存在组织细胞差异性.方法:分别将GCLC 5'端上游序列驱动的荧光素酶报道基因载体GCLC-Luc、E-box缺失的delE-box-GCLC-Luc及pGL3-enhancer空载体瞬时转染大鼠不同组织来源的细胞,测得荧光素酶活性;并经蛋白定量及pSV-β-半乳糖苷酶的活性测定,获得校正荧光素酶活性值,通过比较校正荧光素酶活性值差异间接判断E-box元件对GCLC转录活性的影响.结果:在大鼠心肌细胞H9C2(2-1),转染delE-box-GCLC-Luc组荧光素酶活性值较转染GCLC-Luc组明显升高(P＜0.001),说明E-box能使其GCLC转录活性下调;在大鼠肾小球细胞HBZY-1,转染delE-box-GCLC-Luc组荧光素酶活性值较GCLC-Luc组明显降低(P＜0.02),提示E-box具有上调该细胞GCLC转录活性的作用;而在大鼠神经胶质瘤细胞C6和小肠隐窝上皮细胞IEC-6,组间差异无统计学意义(P＞0.05),提示 E-box对其GCLC转录活性无影响.结论: E-box元件能组织特异性的调控大鼠GCLC基因的转录,该元件可能是决定GCLC基因存在组织差异性表达的重要顺式作用元件.
关键词： γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 氧化应激 E-box元件 组织特异性转录 大鼠
