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阴道毛滴虫LAG1基因启动子区克隆及分析
本研究旨在克隆并分析阴道毛滴虫LAG1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控提供实验资料.预测启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,然后测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果表明在构建的6种荧光素酶报告基因表达体系及2种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系中,表达载体pGL3-455(-455～+55 bp)、pGL3-417(-417～+55 bp)、pGL3-280(-280～+55 bp)、pGL3-202(-202～+55 bp)、pGt3-81(-81～+55 bp)的荧光素酶表达活性相近,均明显高于表达载体pGL347(-47～+55 bp)荧光素酶表达活性,而pGL3-47表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近,提示-47～+55 bp区无启动子活性.绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-81(-81～+55 bp)有明显的绿色荧光蛋白表达,而pEGFP-47(-47～+55 bp)和空载体pEGFP-1未见表达.因此-81～-47 bp区域含有阴道毛滴虫LAG1基因转录所必需的基本启动子序列.
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NS2TP基因启动子报告基因载体的构建及其活性验证
目的研究丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因（NS2TP）的转录调节机制。方法应用PCR方法扩增NS2TP的启动子，克隆入pGL4.10载体，构建萤虫素酶报告基因载体，转染HepG2细胞，检测双萤虫素酶活性，验证其转录活性；通过缺失突变法构建系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体。结果成功构建了系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体，分别命名为N1、N2、N3和N4，并确定了N3为NS2TP基因的核心启动子。结论构建NS2TP基因启动子的系列截短报告基因载体，确定了其小转录活性区域，为进一步研究NS2TP基因的转录活性调节机制奠定理论基础。
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构建IL-4启动子区报告基因载体探讨甲基化对其启动子调控活性的影响
目的 白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)在特应性皮炎等疾病的发病机制中发挥着关键的作用,但其基因甲基化改变与疾病相关性尚不明确.本研究通过构建荧光素报告基因载体,检测DNA甲基化对于IL-4基因启动子转录活性的影响.方法 以Jurkat细胞基因组DNA为模板,PCR扩增IL-4启动子调控序列片段,连接入克隆载体psiCHECK荧光素报告载体.采用补丁甲基化(patch methylation)技术,在体外对IL-4启动子基因片段进行甲基化处理,构建甲基化IL-4启动子报告基因载体.采用电穿孔转染技术,将psiCHECK-IL-4-promoter荧光素报告载体转染至Jurkat细胞,对甲基化和未甲基化载体的荧光素酶进行检测,比较其对IL-4基因转录水平的影响.结果 琼脂糖凝胶电泳证实获得了IL-4启动子区域基因序列,测序结果与Genbank中一致,成功构建了IL-4启动序列及其甲基化的psiCHECK-IL-4-promoter荧光素酶报告基因载体.经检测,甲基化报告基因载体的转录活性较未甲基化载体明显降低,相对比例为0.43∶1.结论 IL-4启动子序列低甲基化可导致其转录活性升高,上调IL-4表达水平.
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以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立
目的 通过双荧光素酶报告基因检测系统建立以胰岛素诱导基因2(insulin-induced gene 2,Insig-2)启动子为靶点的药物筛选模型.方法 将人Insig-2基因启动子序列克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建重组质粒 pGL3-Insig-2并与内参质粒 pRL-TK 瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映Insig-2基因启动子启动转录的活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证.结果 成功构建了重组质粒pGL3-Insig-2;确认pGL3-Insig-2:pRL-TK共转染比例为4:1,确定3T3-L1细胞为工具细胞;1,25-(OH)2D3、小檗碱和姜黄素均能明显增强Insig-2基因启动子活性.结论 成功建立了以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型,为筛选新型调脂药奠定基础.
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Klotho基因启动子区域定位及活性分析
目的 构建含不同长度klotho基因启动子片段的报告基因载体,研究其在不同细胞系中的转录活性.方法 以人全血基因组DNA为模板,克隆长短不同的klotho基因启动子片段,命名为klothoⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ;分别克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic构建真核表达载体;采用Lipofectamine 2000将重组质粒分别和pRL-TK共转染HEK293和HeLa细胞,分析不同长度的klotho基因启动子片段在细胞内的转录活性.结果 双酶切和测序鉴定均显示表达载体构建成功;klotho基因的核心启动子区域位于-504～-6;双荧光素酶活性检测显示klothoⅢ在2种细胞中的转录活性明显高于klothoⅠ、Ⅱ(P<0.05),而klothoⅣ的转录活性在HEK293细胞中能维持高水平,在HeLa细胞中显著下降(P<0.01).结论 klotho基因启动子在不同细胞中的转录活性不同,-973～-504区域可能是导致HeLa细胞中klothoⅣ转录活性下降的原因.
