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Wnt-1在大鼠气管干细胞早期增殖与分化过程中的表达
目的检测Wnt-l在大鼠气管上皮损伤修复中的表达及其变化,探讨影响气管干细胞早期增殖分化的分子调控机制.方法氟脲嘧啶(5-FU)作用大鼠离体气管,去除5-FU后分别于0、6、12、24及48 h用Westernblotting及免疫组织化学方法检测气管上皮中Wnt-1的表达.结果 5-FU损伤后12 h,气管上皮脱落,仅残留少量G0期细胞表达Wnt-1;去除5-FU后6 h,上皮细胞数目增多,呈扁平状间断分布,Wnt-1表达强;12 h后,上皮细胞呈立方状,并连接成片,Wnt-1表达逐渐减少;恢复48 h,气管上皮内出现假复层结构,仅见极少量Wnt-1阳性细胞.正常气管上皮Wnt-1表达极少. 结论 Wnt-1时间依赖性表达与气管上皮损伤修复进程相吻合,说明其在气管干细胞早期增殖分化中起重要调控作用.
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组蛋白去乙酰化酶1在人气管上皮损伤修复过程中的表达
目的 检测组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)在人气管上皮损伤修复中的表达及其变化,探讨影响气管干细胞增殖分化的分子调控机制.方法 5-氟尿嘧啶(5-FU)造成人离体气管上皮损伤,应用免疫组织化学和Western blotting方法检测修复过程中各时间点气管上皮HDAC1的表达.结果 去除5-FU后0h,气管上皮脱落,仅残留少量G0期细胞,HDAC1表达阴性; 3～6h,细胞数量增多,为扁平状,未见明显HDAC1阳性细胞;12h,上皮细胞由扁平变立方并连接成片,HDAC1阳性细胞数明显增多,并可见数个HDAC1阳性细胞围绕着底部1个HDAC1阴性细胞和多个HDAC1阳性细胞间夹着数个HDAC1阴性细胞分布的现象;24h,细胞数继续增多并变复层,HDAC1阳性细胞数多,累及全层;48h,接近假复层结构,HDAC1阳性细胞数略减少,阳性细胞分布集中于假复层结构顶部即靠近管腔侧;正常气管上皮HDAC1表达阴性.Western blotting分析显示,HDAC1表达量的变化趋势与免疫组织化学结果一致.结论 随着气管干细胞分化细胞数增多,HDAC1阳性细胞数明显增多,提示HDAC1可作为气管干细胞由增殖转向分化的分子开关.
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Wnt信号通路在大鼠气管干细胞增殖分化过程中的时空表达
背景:实验前期项目己协同有关人员创立了体外观察气管干细胞的模型,并解决了气管干细胞的定位、分离及性状分析.但在气管干细胞的增殖分化过程中,究竟有哪些基因参与及其各自作用、气管干细胞可产生功能细胞的分化程序至今仍不清楚.目的:利用氟尿嘧啶诱发离体气管上皮损伤,检测气管干细胞增殖分化损伤重建过程中Wnt信号途径成员的时空表达变化.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-06/2007-06在沈阳医学院中心实验室完成.材料:清洁级2周龄Wistar大鼠18只,用于制备离体气管环.氟尿嘧啶由天津人民制药厂生产.方法:将镜下观察纤毛摆动情况良好的气管环分为两组:损伤组将气管环置于含12.5mg/L氟尿嘧啶的HamsF-12液中,作用12h后去除氟尿啼啶,换成新鲜的HamsF-12液继续培养,分别于3,6,12,24,48h取部分等量组织块.对照组用等体积HamsF-12液代替氟尿嘧啶,其余培养条件及取材时间同损伤组.主要观察指标:RT-PCR法检测气管上皮中Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc基因表达的变化.结果:氟尿嘧啶作用12h后,光镜下可见少数间隔分布、近于裸核的细胞,呈钉状位于基底膜上,前期实验己证明其为气管干细胞.RT-PCR结果显示,对照组气管上皮无Wnt-1和T细胞因子mRNA的表达,β-连环蛋白与c-myc mRNA轻度表达.损伤组经氟尿嘧啶作用后,可检测到Wnt-1 mRNA的表达,β-连环蛋白mRNA一时性轻度下降:Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc mRNA分别于去除氟尿嘧啶后3,6,12h达到高峰;24h后三者mRNA表达水平均下调:至48h Wnt-1 mRNA无表达,后三者mRNA少量表达.结论:在整个气管上皮重建过程中,Wntl、β-连环蛋白、T细胞因子和c-myc mRNA的表达变化基本遵循相似的规律,提示Wnt信号通路作为一个整体参与气管干细胞增殖分化过程的调控.
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大鼠气管干细胞增殖分化过程Wnt/β-Catenin信号分子的表达
背景:干细胞和细胞外基质的互相作用需要Wnt信号途径的参与.在气管损伤后的修复过程中,不同的分子信号级联控制干细胞的迁移、增生与分化,Wnt信号途径是否参与其中?目的:检测并验证Wnt/β-Catenin信号途径在气管干细胞增殖分化中的作用.设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2004-05/2006-07在沈阳医学院完成.材料:2周龄Wistar 大鼠,雌雄不拘,作为离体气管来源.方法:实验组以含氟尿嘧啶的Hams F12培养液作用离体大鼠气管,作用12h后换成单纯Hams F12液,对照组只用HamsF12液培养.主要观察指标:去除氟尿嘧啶后于0,6,12,24,48h采用免疫组织化学sP染色及蛋白印迹法检测气管上皮中Wnt-1和β-Catenin的表达.结果:氟尿嘧啶作用12 h后,大鼠气管上皮细胞绝大部分脱落,暴露出基底膜,仅剩余少数较分散的间隔分布的近于裸核的细胞,呈钉状位于基底膜上.氟尿嘧啶去除6 h后,气管基底膜上可见少量扁平样细胞.24 h后基底膜上细胞数目增加,并逐渐分化旱立方状,连接成片.48 h后气管上皮中出现假复层柱状上皮,并可见纤毛细胞.免疫组织化学及蛋白定量结果显示:正常及损伤后0 h气管上皮极少量表达Wnt-1及β-Catenin,损伤后6 hWnt-1及β-Catenin表达强,其后随时间延长,表达逐渐减少.结论:Wnt-1时间依赖性表达与气管上皮损伤修复进程相吻合,胞浆中游离状态的13.Catenin表达可能产生了促进气管干细胞的增殖并抑制其分化的作用.
