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一种HCV靶向性M1GS核酶的构建及其体外活性
目的 构建对HCV基因组具有特异切割作用的新型靶向性核酶-M1GS.方法 针对HCV基因组的保守区(5'UTR)设计并合成一段引导序列,通过PCR扩增直接将该引导序列连接于大肠杆菌核糖核酸酶P的催化亚基(M1 RNA)的3'末端,从而构建一类靶向性M1GS核酶.结果 体外切割实验表明,所构建的核酶(MIGS-HCV/C67)对HCV 5'UTR具有明显的切割作用,切割的位点在靶序列67～68 nt之间,属于特异性切割.结论 构建了一种对HCV 5'UTR具有靶向切割活性的MIGS核酶,为胞内反义效应及动物模型内抗病毒效应的评价提供了实验材料,为新型抗HCV药物的研究奠定了基础.
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抗CⅡTA RNaseP(M1-3408-GS)的生物学活性
目的通过抗CⅡTA RNaseP抑制HeLa细胞表面MHCⅡ分子的表达. 方法 M1-RNA是RNaseP的催化活性单位,从包含M1-RNA的pTK117质粒克隆抗CⅡTA RNaseP(M1-3408-GS),定向插入腺相关病毒载体psNAV(psNAV-M1-3408-GS); 以RT-PCR从Raji细胞株克隆靶基因模板,插入pGEM-7zf(+)载体(pGEM-3176).psNAV-M1-3408-GS和pGEM-3176分别进行体外转录和体外切割实验.通过纳米载体介导psNAV-M1-3408-GS质粒稳定转染HeLa细胞,应用流式细胞术检测其表面HLA-DR、DP、DQ抗原表达,RT-PCR检测其CⅡTA mRNA水平. 结果 M1-3408-GS与pGEM-3176体外切割产物电泳见预期切割条带.M1-3408-GS+HeLa细胞与对照组比较,其表面HLA-DR、DP、DQ抗原诱导型表达分别降低了79.21%、90.31%及48.30%;同时诱导型CⅡTA mRNA含量减少. 结论抗CⅡTA核糖核酸酶P(M1-3408-GS)有可能发展为新一代抑制自身免疫疾病的核酸药物.
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靶向C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的实验研究
目的 探讨靶向作用于乙型肝炎病毒C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的作用.方法 设计并应用PCR技术合成M1 RNA核酶,应用pEGFP-C1载体构建M1GSRNA核酶的真核表达质粒,应用脂质体Lipofectamine TM 2000转染HepG2.2.15细胞,以ELISA法检测细胞培养液中病毒抗原.以反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测细胞内病毒mRNA,以荧光定量PCR法检测分泌人培养液的HBV DNA含量,用MTT法检测核酶对细胞增殖活性的影响.结果 质粒载体表达的M1GS RNA核酶能明显抑制细胞培养液中HBeAg的表达及病毒mRNA的表达,抑制率分别为31.58%,32.5%.但M1GS RNA核酶对培养液中的HBV DNA含量无明显影响,亦不影响HepG2.2.15细胞的增殖活性.结论 M1GS RNA核酶能特异性抑制HepG2.2.15细胞内HBV C区基因表达,是一种很有潜力的抗HBV基因治疗方法.
关键词： 核糖核酸酶P M1 RNA核酶 乙型肝炎病毒 基因治疗 HepG2.2.15 -
靶向S区和C区基因的M1GS RNA核酶共同抑制HBV的表达
目的:研究靶向HBV S区和C区基因的M1GSRNA核酶共同作用对HBV基因表达的影响.方法:选择HBV ayw亚型S区基因294 nt和C区基因2333 nt为切割位点,以含有编码M1 RNA的DNA序列的质粒pTK117为模板.通过PCR扩增得到M1GS RNA核酶的DNA模板,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1得到重组质粒pEGFP-GSS和pEGFP-GSC.将2个重组质粒共转染HepG2.2.15细胞,转染后ELISA法测细胞培养液中的HBsAg和HBeAg,RT-PCR检测HBV mRNA.结果:成功构建了分别靶向HBV S区基因和C区基因的真核表达载体.共转染HepG2.2.15细胞后,HBsAg和HBeAg的表达分别被抑制了33.2%和39.1%.HBV C mRNA和S mRNA分别被抑制了32.5%和29.7%,而HepG2.2.15细胞的增殖无明显变化.结论:靶向HBV S区和C区基因的M1GS RNA核酶共同作用可特异性抑制HBV S区和C区基因的表达.
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DNA型EGS抑制HCMV UL97基因的表达及病毒复制
目的 研究DNA型外部引导序列对人巨细胞病毒(HCMV)UL97基因的靶向抑制作用及抗病毒作用.方法 借助计算机软件(RNAStructure4.5)模拟HCMV UL97 RNA的结构,选择二级结构相对简单且具备核糖核酸酶P(RNase P)底物一级结构序列特征的位点作为候选切割靶位,针对不同靶位设计并合成的DNA型EGS.将各EGS分别与体外转录的HCMV UL97 RNA及纯化的人RNase P体外混合,初步筛选具备靶向引导切割活性的EGS.进一步将体外有效的EGS转入HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(HELF),通过Western与Northern印迹法检测EGS在宿主细胞内对靶基因表达的影响.此外,通过空斑试验测定病毒的生长曲线,测定EGS对病毒复制的影响.结果 本文设计并合成了针对HCMV UL97基因6个不同靶位的DNA型EGS( EGS168、EGS212、EGS313、EGS663、EGS1580和EGS1664).体外切割试验证实,EGS212、EGS313、EGS663和 EGS1580具有明显的靶向引导切割作用.在 HCMV 感染的宿主细胞中, EGS212和EGS1580均能够沉默病毒UL97基因的表达,并显著抑制病毒的复制,分别使病毒滴度降低高达约300倍和600倍.结论 本研究成功获得两种具有抗HCMV潜力的DNA型EGS,为进一步研发新型抗HCMV核酸类药物奠定了基础.
