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利用PCR构建多拷贝HIV-1 TAR序列的串联体
建立“自身引物—模板”PCR方法，并应用此方法成功地扩增了多拷贝HIV-1 TAR片段的同向串联体。此方法简便，省力，可用于多拷贝基因探针、多拷贝反义基因片段、多拷贝抗原表位的扩增和克隆。
关键词： 自身引物—模板PCR 串联体 -
人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体的原核表达及纯化
目的:克隆人源抗菌肽( Antimicrobial peptide,AMP)LL-37及其改良体串联体基因,原核表达并纯化重组蛋白.方法:利用生物信息学手段,对人源抗菌肽Ll-37基因序列进行改良设计,合成人源抗菌肽LL-37及其改良体基因片段,经重叠延伸PCR获得人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-dLL-37,转化大肠杆菌BL21( DE3 )pLysS,IPTG诱导表达,Tricine SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式,镍金属螯合亲和层析纯化重组蛋白.结果:改良后的人源抗菌肽LL-37的等电点、稳定性及其在大肠杆菌中的半衰期均显著提高；重组表达质粒pET-28a-dLL-37经测序鉴定构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为11000,主要以包涵体形式存在；纯化的重组蛋白纯度可达95％,浓度为0.473mg/ml.结论:已成功在大肠杆菌中表达并纯化了人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体,为其后续生物学活性的研究奠定了基础.
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胸腺素α1串联体的表达、纯化及生物学活性检测
目的表达胸腺素α1(Thymosin alpha1,Tα1)三串体,并进行纯化及生物学活性鉴定.方法使用大肠杆菌偏爱密码子,人工合成Tα1三串体(Tα1③)基因,在表达载体pET-22b(+)中克隆,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化Tα1③蛋白,采用Western blot鉴定表达产物,MIT法检测其生物学活性.结果获得了纯化的Tα1③蛋白,相对分子质量约为10 000,并具有Tα1③的生物学活性.结论利用基因串联表达小分子多肽是一种可行的方法.
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人胰高血糖素样肽-2类似物基因串联体构建及原核细胞表达
利用同尾酶法构建人胰高血糖素样肽一2类似物{PP-h[Gly2]GLP-2(1-35)}基因串联体重组质粒,实现目的基顺在大肠杆菌中高效表达.通过PCR扩增获得pp-h[Gly2]GLP-2(1-35)基因片段,利用同尾酶BamHI和BclⅠ产生相同的粘性末端,经连接、转化、筛选等操作构建其基因串联体.经DNA测序分析,成功构建PP-h[Gly2]GLP-2(1-35)的二、四、六、八拷贝基因串联体.SDS-PAGE显示.各重组菌经D-乳糖诱导后均表达目的融合蛋白,其相对分子质量与预期结果相符,目的肽含量并非随串联个数增加而明显增加,改变融合伙伴后,目的肽的表达量从0.106 g/L提高到0.372 g/L,为大量制备和纯化pp-h[Gly2]GLP-2(1-35)奠定了基础.
关键词： 人胰高血糖素样肽-2类似物 串联体 同尾酶 -
基因串联体的构建策略及其表达模式
为了获取足够的DNA片段或得到基因的表达产物,常需要构建基因串联体,将目的基因按头尾相连随机串联起来,克隆入克隆载体以制备需要的目的基因片段或克隆入表达载体进行高效表达.串联的策略包括定向串联法、PCR扩增串联法、化学拼接法、同尾酶法等,不同方法构建的串联体基因表达模式也有一定差异.
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肽抗生素hPAB-β基因串联体的构建及原核细胞表达初探
目的: 构建肽抗生素hPAB-β基因多拷贝串联体重组质粒,实现目的基因串联产物在大肠杆菌中的高效表达. 方法:以表达质粒pQE-32为载体,利用同裂酶Pst Ⅰ与Ava Ⅲ能产生相同粘端的特性,通过PCR扩增、酶切、连接、转化等操作,构建含不同数目hPAB-β基因的串联体.对获得的重组菌用异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导表达,Tricine-SDS-PAGE观察串联体融合蛋白的表达情况. 结果: 构建了一至八拷贝的串联体重组质粒,经酶切、DNA测序分析表明,各串联体的DNA序列及阅读框完全正确.Tricine 蛋白电泳显示,各串联体的阳性转化菌株经IPTG诱导后均能表达出目的融合蛋白,相对分子质量与预期结果相符,表达量占细菌总蛋白的10%～22%.但八拷贝较其他串联体表达率有所降低. 结论:hPAB-β基因串联体重组表达质粒的成功构建,为大量制备目的肽抗生素奠定了基础,并为其他小分子生物活性肽的制备提供了参考.
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胸腺素α1二聚体蛋白的克隆、表达、纯化及其生物学活性检测
目的:获得具有生物学活性的重组人胸腺素α1二聚体蛋白.方法:人工合成胸腺素α1二聚体基因,并将该基因克隆入原核表达载体pET-22b(+)中.转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组Tα1②蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测分析以及生物学活性检测.结果:Tα1②Mr约为6.3×103,与理论值一致.成功纯化了Tα1②蛋白,该蛋白具有与T 1抗体特异性的结合能力并能刺激小鼠T淋巴细胞增殖.结论:成功地克隆、表达和纯化Tα1②蛋白;重组Tα1②具有与化学合成Tα1相同的功能并有更高的生物学活性.
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胸腺素α1基因串联体的构建
0 引言胸腺素α1(Thymosin alpha 1, Tα1)是从胸腺素组分5(TF5)中分离纯化出的热稳定酸性多肽[1],由28个氨基酸组成,Mr为3108. 它是一种具有多种生物学活性的免疫调节剂,已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症和免疫缺陷的研究中. 虽然胸腺素α1有着广泛的应用前景,但由于其基因过短,很难利用基因工程方法实现直接表达,所以目前多是化学合成产品[2],价格比较昂贵,应用的推广受到限制. 为了探索胸腺素α1多聚体的可能的生物学活性及其基因的体外表达,我们利用随机退火与PCR技术相结合的方法构建了胸腺素α1的多串体基因,并成功克隆,从而为进一步研究奠定了基础.
