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人乳头瘤病毒样颗粒组装研究进展
病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)作为一种形态结构与真病毒高度相似的空心颗粒,具有真病毒类似特性,在机体内能刺激免疫系统产生高滴度的中和抗体,又因为其缺乏核酸无法复制,近年来一直被作为理想的候选疫苗蛋白.目前上市的三种人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)疫苗都是属于基因工程VLP疫苗.对于HPV VLP组装的研究能够更好的为疫苗研发方面提供更多的优化手段.该文旨在总结这十几年人乳头瘤病毒VLP组装的研究进展,为HPV以及其它病毒的基因工程疫苗研发提供更多有价值的信息,为人类健康作出贡献.
关键词： 人乳头瘤病毒(HPV) 主要衣壳蛋白L1 病毒样颗粒(VLPs) 疫苗 组装 -
人乳头瘤病毒58型衣壳蛋白的表达及其抗体制备
目的:构建人乳头瘤病毒58型(hpy58)衣壳蛋白L1的杆状病毒-昆虫细胞表达系统.方法:用杆状病毒-昆虫细胞表达系统大量表达HPV58L1蛋白,并用HPV58L1病毒相似颗粒(VLP)免疫BALB/c小鼠制备特异性抗血清.结果:HPV58L1蛋白在SF9细胞中被高效表达,其相对分子质量为55kD;CsCl超速离心结合蔗糖密度超速离心可纯化此蛋白.在电镜下可见纯化的病毒衣壳蛋白L1形成VLP.用其免疫小鼠制备的相应抗体能与HPV58L1特异性结合.结论:成功表达了HPV58衣壳蛋白L1,并制备出高滴度的抗体.
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HPV16L1天然变异体在毕赤酵母中的可溶性表达及病毒样颗粒装配
目的 在毕赤酵母中表达两个临床人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV) 16型毒株主要衣壳蛋白L1(HPV 16 L1),并分析表达产物的可溶性及病毒样颗粒(virus-like parcticle,VLP)装配差异.方法 将编码两个不同HPV 16毒株L1蛋白的全长基因序列M16和Y16分别重组于毕赤酵母表达载体pPink LC,构建重组表达质粒Y16LC和M16LC,转化表达菌株pPink strain 1.重组菌经甲醇诱导后,Western blot分析L1蛋白的表达水平及可溶性.经密度梯度离心结合透射电镜观察,分析VLP装配情况.通过软件pubmed在线Alignment分析两个序列的氨基酸排列.结果 两个重组表达质粒经酶切鉴定及测序分析证明构建正确.两个序列获得了相似的蛋白表达水平,但Y16的可溶性较差,几乎且无VLP形成;而MI6呈现较好的蛋白可溶性及VLP装配能力.Y16与M16有5个氨基酸的差异(H202D、T266A、△424S、D441 A、K452Q).结论 HPV 16 L1氨基酸的微小改变尽管未对重组蛋白的表达水平产生影响,但显著影响有功能的预期产物的获得.提示在基因重组病毒疫苗研发中,制备VLP时需考虑毒株的选择,甚至主动进行抗原的特定氨基酸的改造.
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HPV16 L1在整合型重组毕赤酵母中的表达及病毒样颗粒的纯化
目的 构建可稳定表达HPV16 L1的整合型重组毕赤酵母,并纯化自主组装成的HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs).方法 根据酵母密码子偏爱性优化HPV16 L1基因并克隆到pPIC3.5K表达载体,构建pPIC3.5K/HPV16 L1重组质粒;重组质粒经Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化至GS115菌株中,筛选HPV16 L1重组毕赤酵母.阳性整合菌株甲醇诱导后,以HPV16 L1单克隆抗体检测目的蛋白表达;采用肝素亲和层析法纯化HPV16 L1VLPs并进行透射电镜观察.结果 PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3.5K/HPV16 L1重组质粒.成功构建的HPV16 L1重组毕赤酵母甲醇诱导后,Western blot证实重组酵母菌裂解产物存在HPV16 L1目的蛋白.肝素亲和纯化后,透射电镜观察到了直径大约55 nm的VLPs,其形态与HPV16天然病毒颗粒相似.结论 利用整合型重组毕赤酵母表达系统成功表达了HPV16L1蛋白,并用肝素亲和纯化可快速获得结构完整的HPV16 L1VLPs,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础.
