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靶向HIV-1 vif的高效人工miRNA的构建及慢病毒介导的体外抗病毒研究
RNAi在HIV-1的治疗研究中得到了广泛的应用,构建高效并且安全的RNAi抗病毒元件是开展相关研究的基础.vif37是以前的研究中筛选获得的靶向HIV-1 vif的高抑制效率兼具保守性的RNAi靶点.miRNA在抑制效率和启动子的选择上比常用的shRNA具有优势.本研究探索以人工miRNA结构引发vif37靶点对应的RNAi.本研究以天然的miR-155前体为骨架,采用步移的方式设计了3个靶向vif37的人工miRNA,以RNA聚合酶Ⅱ类启动子指导表达.miRNA表达质粒和HIV-1的感染性克隆pNL4-3共转染的结果显示,3个人工miRNA中只有miR-vif37H具有抑制效果,效率与shRNA-vif37相当.与携带靶序列的荧光索酶报告质粒共转染实验证明miR-vif37H具有良好的抑制特异性.用表达miR-vif37H的重组慢病毒转导HIV-1的敏感细胞MT-4,克隆化后获得稳定表达miR-vif37H的细胞株MT-4-miR37H,该细胞可以有效抑制HIV-1的体外复制.实时RT-PCR检测结果显示,与shRNA-vif37相比,miR-vif37H的表达水平明显下降,安全性更好.进一步的实时RT-PCR检测结果还显示,miR-vif37H在细胞内的稳定表达不会影响内源代表性miRNA(miR-181和miR-16)的加工以及干扰素应答相关基因Stat1的mRNA水平.miR-vif37H是一个特异的高效RNAi元件,为vif37靶点的进一步应用研究奠定了基础.
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利用人工miRNA技术建立甲胎蛋白稳定沉默肝癌细胞及沉默效果评价
目的 通过建立靶向甲胎蛋白(AFP)基因的人工microRNA(amiRNA)稳定表达HepG2细胞来评价AFP-amiRNA的沉默效果.方法 构建靶向AFP基因的amiRNA慢病毒表达质粒,将其转入HEK293T细胞包装为慢病毒并感染HepG2细胞,嘌呤霉素筛选2周后采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、间接免疫荧光及AFP定量试剂盒检测amiRNA对AFP的抑制效果.结果 成功构建靶向AFP的amiRNA慢病毒表达质粒,并建立稳定表达AFP-amiRNA的HepG2细胞,RT-PCR、间接免疫荧光与上清AFP定量结果显示稳转细胞AFP表达水平显著降低.结论 高效稳定表达AFP-amiRNA的HepG2细胞株建立成功,并能有效抑制AFP的表达.
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猪Toll样受体7基因人工miRNA表达质粒的构建与筛选
目的 构建猪Toll样受体7(TLR7)基因的人工miRNA (amiRNA)特异性表达载体,筛选有效amiRNA.方法 RT-PCR扩增猪TLR77基因的1984 ～2648 bp序列,构建融合表达载体pTLR7-EGFP.设计针对猪TLR7的5对amiRNA,构建重组干扰质粒pcDNA5-miRTLR7.将pcDNA5-miRTLR7和pTLR7-EGFP共转染NIH-3T3细胞,通过RT-PCR检测amiTLR7的表达,以荧光显微镜观察和流式细胞术分析干扰效率.结果 5个amiTLR7都成功表达,且均能沉默NIH-3T3细胞中TLR7基因的表达,抑制效率为36.99％到97.28％,其中amiTLR7-3效果佳.结论 成功构建了针对猪TLR基因的amiRNA表达质粒,筛选出了沉默猪TLR7基因的佳干扰序列.
关键词： Toll样受体7基因 人工miRNA RNA干扰 筛选 -
趋化因子受体基因CCR5人工miRNA的构建与功能分析
目的 构建人工miR-CCR5,并研究其对HIV-1感染宿主细胞的影响.方法 以miR-155为基础骨架,根据HIV-1 CCR5基因序列设计并合成4对miRNA寡聚单链DNA,构建4个人工miR-CCR5.采用qPCR技术检测其对CCR5基因的沉默效率和对干扰素表达的影响;MTT法测定其对被转染细胞的毒性;抗HIV-1BaL感染实验检测其对HIV-1感染的抑制作用.结果 qPCR结果显示,4个人工miR-CCR5对CCR5基因都具有一定的沉默效果,其中miR-CCR5-4的沉默效率高,达72％;且不会对细胞干扰素的表达产生影响.MTT实验证实miR-CCR5-4不会影响被转染细胞的活性,此外,病毒抑制实验显示,miR-CCR5-4对HIV-1BaL p24蛋白的抑制作用达70.48％,效果明显.结论 所获得的miR-CCR5-4可为进一步的抗HIV-1BaL感染研究提供基础.
