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番鸭呼肠孤病毒YB株σB蛋白的基因序列分析及其原核表达
番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)是造成雏番鸭高死亡率的重要病原体,深入其检测与免疫研究对于防控DRV感染意义重大.利用RT-PCR和测序技术,对3株福建DRV分离株的S3基因进行序列分析,发现DRV-YH、YJL株与禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)遗传距离较近,同源性高达94.6％～98.9％,而DRV-YB株与ARV同源性仅为60.6％～61.7％.构建和鉴定DRV YB株重组原核表达质粒pET-30a-S3,并转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE表明,表达的目的蛋白分子量约为42ku,IPTG适诱导浓度为0.1mM,适诱导时间为5h,适诱导温度为37℃,以包涵体形式存在.薄层扫描显示重组DRV σB蛋白占菌体总量的67.7％.以Ni2+柱亲和层析纯化蛋白,纯化后的目的蛋白纯度为93％,质量浓度为0.86g/L.Western blot分析该融合蛋白能与抗DRV阳性血清发生特异性反应,表明重组DRV σB蛋白具有良好的免疫反应性.
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番鸭呼肠孤病毒的鉴定
从以软脚为主要临床症状,以肝、脾表面有多量灰白色坏死点,肾肿大及出血为主要病变的病番鸭肝、脾组织中分离到5株病毒(MW9710、MW9803、MW9806、MW9809和MW9810).雏番鸭和雏鹅经人工感染后出现与自然病例相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒.樱桃谷鸭、麻鸭和鸡人工感染不发病.经电镜观察,病毒呈球形,正二十面体,立体对称,无囊膜,有双层衣壳,直径为60nm～73nm,病毒粒子在胞浆中增殖.病毒对乙醚、氯仿、胰蛋白酶、50℃处理1h和3%甲醛处理不敏感.对pH3处理2h、60℃处理30min和紫外线照射敏感.1mol/L Mg-Cl2不能增强病毒的感染力.病毒核酸型为dsRNA,病毒核酸具有禽呼肠孤病毒的特征:有10条带,按其大小可分为三类:大片段(L1～L3)、中片段(M1～M3)和小片段(S1～S4).但是MW9710株的M2和S1～S4片段的迁移率明显不同于鸡关节炎病毒(ARV)S1133株,而与番鸭呼肠孤病毒法国株(89330、89026株)的核酸电泳图谱极为相似.在血清中和试验中,ARV S1133和MW9710株互不交叉.并且,以针对ARV S1基因的特异性引物XZ11、XZ12对MW9710株等进行RT-PCR扩增,只能从ARV中扩增出特异性条带;而以MDRV89026株S1基因的特异引物HP11、HP12进行RT-PCR扩增,只能从MW9710等分离毒株中扩增出特异性条带.上述结果表明,MW9710株等5株病毒是上述疫病(番鸭"肝白点病")的病原,属呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属番鸭呼肠孤病毒.
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番鸭呼肠孤病毒感染诱导细胞自噬的研究
本研究通过透射电镜观察自噬体的形态学结构,蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞自噬相关蛋白LC3 Ⅱ和磷酸化mTOR (p-mTOR)表达量的动态变化趋势,探索番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染对细胞自噬的影响.结果显示,MDRV-YB株感染的DF-1细胞中可见典型的包裹胞浆成分的双层膜结构;MDRV感染番鸭成纤维细胞(MDFs)和DF-1细胞后0～60h内,其LC3Ⅱ表达量均呈现先升高后降低的趋势,且均在感染后36 h达到大值,其p-mTOR表达量均呈现先降低后回升的趋势,且分别在感染后36h和24h达到低值;灭活MDRV组细胞未见LC3Ⅱ表达.结果表明MDRV能够诱导感染的MDFs和DF-1细胞持续较长时间细胞自噬,而灭活的MDRV不能引起细胞自噬.
