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苦参碱含药血清对WB-F344细胞形态、增殖和Jagged1信号分子表达的影响
目的 研究苦参碱含药血清对大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞形态、增殖及Jagged1信号分子表达的影响,探讨苦参碱对肝干细胞诱导分化的作用机制.方法 用不同浓度苦参碱含药血清(5%、1 0%、20%)作用于WB-F344细胞,以未用苦参碱含药血清处理的WB-F344细胞为空白对照组,观察细胞形态学改变,MTT法检测细胞增殖情况,免疫细胞化学法观察ALB、Jagged1蛋白表达变化,RT-PCR观察Jagged1、Hes1mRNA表达的变化.结果 经苦参碱含药血清干预后,WB-F344细胞形态发生明显改变:药物组细胞较对照组细胞体积增大,核缩小,核浆比减小,培养48 h大部分细胞呈多边形.MTT结果显示,5%、10%、20%浓度的苦参碱含药血清24、48、72 h均能不同程度抑制WB-F344增殖,且存在时间、剂量依赖性.免疫细胞化学结果显示,空白对照组WB-F344细胞表达Jagged1蛋白,不表达ALB蛋白,经苦参碱含药血清处理后Jaggedl蛋白表达显著下降(P＜0.01),ALB蛋白表达显著升高(P＜0.01).RT-PCR结果显示,经苦参碱含药血清处理后Jagged1mRNA、Hes1mRNA表达显著下降(P＜0.01).结论 苦参碱含药血清可诱导WB-F344细胞向肝细胞特性方向分化,其作用机制与调节Notch信号通路的关键分子有关.
关键词： 苦参碱 药物血清 WB-F344细胞 Notch-Jagged信号通路 -
双环醇拮抗DDT引起的细胞间隙连接通讯功能抑制研究
目的 研究治肝炎药物双环醇对促癌剂滴滴涕(DDT)引起细胞间隙连接通讯(GJIC)功能抑制的拮抗作用及作用机制.方法 划痕标记染料示踪技术直接观察DDT引起的大鼠肝上皮WB-F344细胞GJIC功能抑制并分析双环醇的作用.利用Western blot方法检测间隙连接蛋白43(Cx43)、磷酸化Cx43、E-cadherin及β-Catenin的表达和活性.细胞免疫荧光技术考察WB-F344细胞Cx43蛋白亚细胞定位、间隙连接的形成及E-cadherin和β-Catenin在细胞内的表达.结果 DDT能剂量依赖性的抑制WB-F344细胞GJIC功能,20μM浓度时小分子荧光染料Lucifer yellow CH仅能从伤沿细胞向后传递1-2列细胞.双环醇能部分恢复DDT引起的GJIC功能抑制,且具有一定剂量依赖关系,其作用机制与抑制DDT引起的磷酸化Cx43蛋白表达量升高,进而恢复DDT损伤的间隙连接形成有关.DDT和双环醇对与Cx43蛋白功能密切相关的E-cadherin及β-Catenin的表达、活性及细胞内定位均无明显影响.结论 双环醇能通过影响Cx43蛋白的磷酸化水平,部分恢复环境促癌剂DDT引起的WB-F344细胞间隙连接的形成,改善GJIC功能.对GJIC的功能抑制是多种促癌剂诱发肿瘤发生的重要原因,前期研究显示双环醇具预防二甲基亚硝胺/苯巴比妥诱发肝癌发生的作用,本文研究结果进一步提示,双环醇在预防杀虫剂DDT(一种主要的环境致癌物)诱发的肿瘤方面亦具有一定潜能.
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稳定表达人白细胞介素2肝干细胞系的建立
目的:通过逆转录病毒介导,建立能稳定高效表达白介素2的肝干细胞WB-F344.方法:构建逆转录病毒载体Plpcx-IL-2质粒,转染包装细胞PT67,收集细胞培养上清,检测病毒的滴度.将高滴度的PT67/Plpcx-IL-2病毒液感染肝干细胞WB-F344,用嘌呤霉索加压筛选出抗性克隆,并用RT-PCR、间接免疫荧光实验、免疫组化实验和Western blot实验证实抗性细胞在转录水平和蛋白水平均有白介素2的表达情况.结果:成功构建含白介素2的逆转录病毒载体,获得滴度为10~5 CFU/ml的感染性病毒液.建立的细胞系在转录水平和蛋白水平均有白介素2的表达.结论:成功建立了稳定表达人白细胞介素2的肝干细胞系WB-F344/Plpcx-IL-2,为下一步开展研究以肝干细胞为载体肝癌免疫基因治疗奠定了基础.
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丁酸钠体外诱导大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞分化为胆管上皮细胞
目的:观察不同浓度丁酸钠对大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞生长、分化的影响,探讨丁酸钠体外诱导WB-F344细胞分化为胆管上皮细胞的条件及分化规律.方法:不同浓度丁酸钠(0.75、2.25、3.75、4.5 mmol/L)作用于WB-F344细胞(丁酸钠处理组),观察细胞形态学的变化,MTT法检测细胞生长情况,3.75 mmol/L丁酸钠作用WB-F344细胞后,免疫组化观察细胞角蛋白19(CK19)蛋白表达的变化;RT-PCR观察CK19、β4-整合蛋白、γ-谷胺酰转肽酶(GGT)以及甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB) mRNA表达的变化.以同期常规培养未作处理的WB-F344细胞作为空白对照组.结果:丁酸钠处理后,各组WB-F344细胞生长均受到抑制,3.75、4.5 mmol/L丁酸钠处理组光密度值明显低于空白对照组(P＜0.01),而0.75、2.25 mmol/L组与空白对照组无明显差异;3.75、4.5 mmol/L丁酸钠诱导后细胞变大变圆,细胞核增大,核质比减小,而0.75、2.25 mmol/L组细胞形态无显著变化.3.75 mmol/L丁酸钠处理组WB-F344细胞CK19阳性率为(92.3±1.1)%,明显高于空白对照组(1.3±0.2)%(P＜0.01).3.75 mmol/L丁酸钠处理组可见β4-integrin表达,而空白对照组未见表达;GGT、CK19表达较空白对照组增强;空白对照组见AFP表达,而3.75 mmol/L丁酸钠处理组未见表达;ALB在两组均未见表达.结论:3.75 mmol/L丁酸钠适合体外诱导大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞向胆管上皮细胞分化.
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三维培养条件下WB-F344细胞膜流动性及粘附分子表达变化
目的 探讨三维培养条件下对WB-F344细胞膜流动性的影响和粘附分子表达的变化.方法 通过荧光偏振法检测细胞膜流动性变化,并用半定量RT-PCR技术检测细胞粘附分子表达变化情况.结果 与平面培养的细胞相比,三维培养的细胞膜荧光偏振度与生物膜粘度下降,说明细胞膜流动性增加.三维培养和平面培养下,各种粘附分子均可表达,而三维培养条件下纤粘连蛋白(Fn)和整合素-β1(integrin-β1)mRNA的表达明显上调,整合素-α5的表达也有所增加.结论 三维培养可提高WB-F344细胞膜流动性从而维持细胞膜的功能,并上调粘附分子的表达.
