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通心络下调RAGE-MAPK信号通路拮抗AGEs诱导的人内皮祖细胞内皮分化异常
目的:观察通心络对晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)诱导人内皮祖细胞(human endothelialprogenitor cells,hEPCs)内皮分化的影响及其分子机制.方法:自健康人外周血体外培养hEPCs,给予AGEs和或不同浓度的通心络(tongxinluo,TXL)刺激,首先观察其对置于体外matrigel环境中hEPCs内皮分化的影响,随后针对相关的受体分子信号通路进行干预,明确上述信号通路哪些参与TXL的保护作用.结果:①单纯TXL刺激即可显著提高hEPCs的内皮分化水平,并呈一定的剂量依赖性;②与AGEs刺激组比较,TXL干预并可显著改善AGEs导致的hEPCs内皮分化异常;③RAGE-MAPK通路介导了TXL的内皮分化保护作用.结论:TXL干预可通过下调RAGE-MAPK信号通路,显著改善AGEs介导的hEPCs内皮分化异常,这可能是TXL发挥其血管保护作用,特别是糖尿病病理环境下的重要机制之一.
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腺病毒介导肿瘤坏死因子样弱凋亡因子转染对大鼠骨髓基质干细胞内皮分化的影响
目的 研究转染腺病毒介导的肿瘤坏死因子样弱凋亡因子(tumor necrosis factor like weak inducer of apoptosis,TWEAK)对大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,MSCs)内皮分化功能的影响.方法 用密度梯度离心法培养纯化扩增大鼠MSCs细胞,将实验细胞分为转染Ad5CMV-TWEAK的实验组和未经转染的对照组,转染后用生长因子诱导其分化,用CD34和Ⅷ因子相关抗原染色鉴定其分化能力;细胞计数法观测转染TWEAK后MSCs内皮分化细胞增殖的影响;胶面生长实验观察转染TWEAK对MSCs微血管形成能力的影响.结果 大鼠MSCs转染TWEAK基因经诱导分化后的CD34和Ⅷ因子相关抗原染色阳性细胞数量增多,与对照组相比有统计学差异(P<0.05).转染组内皮分化细胞数量增长较快,与对照组相比有统计学意义(P<0.05).胶面生长实验显示转染TWEAK组细胞微血管新生明显.结论 TWEAK基因能促进MSCs向内皮分化,并能促进内皮细胞增殖,在一定的条件下,可促进微血管新生,这为进一步研究其作为诱导体外接种细胞血管发生的基因奠定了基础.
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慢病毒介导的降钙素基因相关肽转染对大鼠骨髓间充质干细胞内皮分化的影响
目的:研究慢病毒介导的降钙素基因相关肽(caleitonin gene-related peptide,CGRP)基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)内皮分化功能的影响.方法:用密度梯度离心结合贴壁法培养大鼠骨髓MSCs,携带CGRP的慢病毒载体转染MSCs,未转染MSCs作为对照,应用ELISA法检测CGRP蛋白表达;实验分为转染Lenti-CGRP的MSCs (CGRP)组、转染Lenti-CGRP的MSCs+ CGRP受体拮抗剂(CGRP8-37)组(CGRP+CGRP8-37)及未经转染的对照组.应用免疫细胞化学检测细胞CD31和Ⅷ因子相关抗原的表达以鉴定其分化能力;细胞计数法观察转染CGRP后MSCs增殖的影响;Matrigel实验观察转染CGRP对MSCs形成管腔样结构能力的影响.结果:MSCs转染CGRP基因经诱导分化后的CD31和Ⅷ因子相关抗原阳性细胞数量增多,与对照组相比有显著差异(P ＜0.05);转染CGRP组细胞数量增长较快,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);Matrigel实验显示转染CGRP组细胞微血管新生明显,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).而CGRP+ CGRP8-37组上述作用明显被抑制.结论:转染CGRP基因能促进MSCs向内皮分化,并能促进内皮细胞增殖,在一定的条件下,可促进微血管新生.
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大鼠脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞向内皮分化的能力比较
目的：研究脂肪干细胞（ASCs）向内皮分化的能力，并与骨髓间充质干细胞（BMSCs）对比。方法从SD大鼠中分离培养ASCs、BMSCs，选择生长良好的一定代数的细胞，流式细胞仪鉴定细胞表面标志物；用CCK-8法绘制细胞生长曲线；进行标准内皮诱导3周，用qPCR检测内皮细胞特异性标志物CD31、KDR、vWF mRNA的表达；免疫荧光染色观察表面抗原CD31的表达；用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）检测诱导组细胞的摄取功能；在Matrigel上验证诱导组细胞的成管能力。结果成功分离培养大鼠ASCs和BMSCs，形态上，ASCs与BMSCs类似，均呈长梭形、纺锤状，类成纤维细胞样形态；流式检测结果显示BMSCs与ASCs均高表达间充质干细胞表面标志物CD29（100%与96.9%）、CD90（96.5%与99.2%），低表达造血系细胞表面标志物CD45（3.9%与0.8%），证实所提取的是间充质干细胞；CCK-8增殖实验结果表明， ASCs的增殖速度比BMSCs的增殖速度快（P<0.05）。标准内皮诱导后，qPCR显示诱导组BMSCs和ASCs表达CD31、KDR、vWF mRNA水平均高于未诱导组（P<0.05）；免疫荧光染色显示CD31抗原表达在诱导组的细胞膜表面；荧光显微镜下诱导组细胞摄取Dil-Ac-LDL（未诱导组不摄取）；诱导组细胞在Matrigel上均具备成管能力，证实诱导后的细胞为内皮细胞。结论表明BMSCs和ASCs均可诱导向内皮细胞分化，ASCs广泛分化为内皮细胞的时间更短且增殖能力更强，提示ASCs比BMSCs更具有应用前景。
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调节ALK5受体活化水平优化间充质干细胞的内皮分化及组织工程血管的应用
[目的]目前干细胞分化内皮细胞(EC)用于血管治疗受限于分化率,既往研究提示转化生长因子β1(TGFβ1)参与内皮分化的调控,其作用因受体途径及分化阶段而不同.本实验即研究TGFβ1主要Ⅰ型受体ALK5活化水平与间充质干细胞(MSC)的内皮细胞分化效率间的关系及分化内皮细胞应用组织工程血管的研究.[方法]采用差速贴壁及流式分选获得大鼠骨髓CD31-MSC,以含VEGF、bFGF及EGM-2的培养基内皮诱导2周组作标准对照组,实验组为分阶段添加TGFβ1活化ALK5组、SB431542抑制ALK5组；免疫荧光检测分化中内皮细胞标志蛋白vWF、KDR动态表达;诱导14 d后通过流式细胞术分析各组CD31+百分率比较诱导效率,并检测诱导细胞体外血管形成功能,后将分化的内皮细胞体外种植于脱细胞基质血管表面构建组织工程血管.[结果]基于KDR、vWF表达变化,间充质干细胞分化以第7天为界分为间充质干细胞分化血管祖细胞及血管祖细胞分化内皮细胞两期.早期活化ALK5(VFT组)、后期抑制ALK5组(VFS组)其CD31+百分率分别为(9.65±2.75)％、(2.28±0.20)％,较标准组提高7.7倍(P=0.006)、1.8倍(P=0.013),差异具有统计学意义;诱导细胞具有体外成血管功能并可应用组织工程血管内膜层重建.[结论]ALK5受体途径在骨髓间充质干细胞分化内皮细胞中呈阶段相关性:间充质干细胞分化血管祖细胞阶段活化ALK5促进内皮分化,血管祖细胞分化内皮细胞阶段则抑制ALK5促进内皮分化；提高内皮分化效率的细胞可应用组织工程血管内皮化.
