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基于相对和绝对定量同位素标记技术的脾气虚大鼠回肠蛋白质组学研究
目的:应用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术研究脾气虚大鼠回肠蛋白质组的表达,寻找有意义的差异蛋白,为探索脾气虚证的现代科学本质提供新的实验方法与依据.方法:12只健康雄性SD大鼠随机分为正常组和脾气虚组,脾气虚组采用饮食不节加力竭游泳方法造模,15d后分离提取回肠总蛋白,以iTRAQ试剂标记后进行质谱检测,并对差异表达的蛋白进行生物学分析.结果:与正常组比较,脾气虚组回肠271个上调蛋白,303个下调蛋白;Pathway显著性富集分析确定下调差异蛋白参与的主要生化代谢途径和信号转导途径有细胞外基质受体交互作用、黏着斑等19条,上调差异蛋白参与包括PPAR信号通路、甾类激素生物合成在内的通路24条.选择细胞外基质受体交互作用为兴趣通路,发现与小肠屏障功能密切相关的层粘连蛋白、胶原蛋白以及整合蛋白等19个蛋白发生下调.结论:脾气虚证可能与回肠细胞外基质受体交互作用通路改变及回肠黏膜屏障功能受损相关.
关键词： 脾气虚证 蛋白质组 相对和绝对定量同位素标记 细胞外基质受体交互作用 回肠 -
基于iTRAQ技术研究丹参酮Ⅱ A对高脂血症大鼠肝脏蛋白质的影响
目的 应用相对和绝对定量同位素标记技术(iTRAQ)研究丹参酮Ⅱ A对高脂血症大鼠肝脏蛋白质组表达的影响,探讨丹参酮Ⅱ A对肝脏保护的作用.方法 24只SD大鼠随机分为空白对照组、高脂血症组和丹参酮组,每组8只.空白对照组每日给予普通大鼠饲料喂饲.高脂血症组和丹参酮组给予高脂饲料喂饲,4周后丹参酮组予丹参酮Ⅱ A磺酸钠10 mg/(kg·d)腹腔注射,空白对照组、高脂血症组给予等体积的磷酸盐缓冲生理盐水腹腔注射.用药8周后检测大鼠血脂、肝功能情况以及肝脏组织形态学变化.分离提取肝脏总蛋白,以iTRAQ试剂标记后进行质谱检测并以软件分析差异表达的蛋白质,用Western blot方法验证部分差异蛋白的表达趋势.结果 与空白对照组比较,高脂血症组血清TC、TG、LDL-C、ALT、AST水平升高(P＜0.01),HDL-C水平降低(P＜0.01);与高脂血症组比较,丹参酮组血清中ALT、AST水平降低(P＜0.05).iTRAQ技术分析发现:丹参酮组肝脏中CES1、Apoa1、Acots2、3-KAT及细胞色素P450家族Cyp3a2、Cyp3a18、Cyp4a3、Cyp2 b2、Cyp2c23这9个差异蛋白表达量上调,Tkt及eNT表达下调.Western blot验证差异蛋白CES1、Apoa1、Acots2变化趋势与蛋白质组结果相一致.结论 丹参酮Ⅱ A可能通过促进胆固醇逆向转运、脂肪酸氧化,改善肝脏代谢功能,减少肝脏脂质沉积,达到其肝脏保护作用.
关键词： 丹参酮Ⅱ A 高脂血症 相对和绝对定量同位素标记 肝脏 -
利用iTRAQ技术联合2D LC-MS研究不同加工工艺鹿茸的差异蛋白质组学
利用iTRAQ同位素标记法结合2D LC-MS/MS法对不同加工工艺鹿茸(鲜品、煮炸、直接冻干、匀浆、冻干加保护剂、冻干未加保护剂、冻干加保护剂40℃,10天)进行比较蛋白质组研究.经质谱共分析共得到蛋白质1 015种.利用Protein Pilot软件(Version 4.5)进行比较分析,差异蛋白(阈值在＞1.50或＜0.60范围,P≤0.05)蛋白为87种.变化大的是煮炸鹿茸组,其差异蛋白质(P≤0.05)相对于鹿茸鲜品,上调蛋白质有24种,下调蛋白质有33种.7种差异极显著(P≤0.001)下调蛋白多具有参与钙离子结合及ATP结合等功能.其他组差异蛋白质种类没有明显变化,与通过层次聚类分析的结果相同.冻干加保护剂(海藻糖)工艺可提高差异极显著蛋白质包括Ⅱ型、Ⅻ型胶原蛋白质(P≤0.001)的相对含量,并且使得功能显著蛋白质与鲜品鹿茸比较,含量相对增加.这些蛋白具有活化血小板、维护精原细胞、使肿瘤细胞表达失调等生理功能.通过对差异蛋白质的层次聚类(hierarchical clustering)及GO (gene ontology)注释分析,表明不同加工工艺鹿茸与鲜品鹿茸的差异蛋白质在分子功能、生物过程及细胞成分中,具有广泛的生物学功能覆盖范围,其中分子功能主要体现在结合功能(52.7％)、催化活性功能(25.3％)、结构分子活性及转运功能(6.6％).
关键词： 相对和绝对定量同位素标记 鹿茸 差异蛋白质组学 2DLC-MS 生物学信息 -
亚砷酸钠诱导大鼠肝纤维化的蛋白组学观察
目的 观察亚砷酸钠慢性饮水染毒诱导大鼠肝纤维化的蛋白组学改变.方法 将40只健康8周龄无特定病原体(specefic pathogen free,SPF) Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠按体质量采用随机数字表法分为4组,每组10只,分别为对照组(饮用去离子水)及低、中、高剂量染砷组(饮用0.68、1.36、2.73 mg/kg亚砷酸钠溶液).自由饮水24周时,采集大鼠血样,取肝脏.采用酶联免疫分析(ELISA)法检测肝纤维化指标:血清透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层粘连蛋白(LN).基于相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)的8标实验,结合二维液相色谱串联质谱(2DLC-MS/MS),检测对照组和中、高剂量染砷组大鼠肝脏组织差异蛋白表达.结果 对照组,低、中、高剂量染砷组血清HA分别为(198.51±16.64)、(218.39±34.98)、(261.72±30.56)、(297.31±35.72)ng/L,PCⅢ分别为(15.32±2.15)、(16.78±2.64)、(19.51±0.85)、(21.42±1.63) μg/L,LN分别为(734.57±86.00)、(792.65±94.15)、(916.83±84.40)、(1 008.09±64.17)μg/L,Ⅳ-C分别为(52.34±14.65)、(59.72±12.84)、(74.38±4.83)、(78.46±4.30)μg/L,组间比较差异均有统计学意义(F=21.136、19.957、22.007、14.288,P均＜0.05).其中,中、高剂量染砷组上述指标均高于对照组和低剂量染砷组(P均＜ 0.05),且高剂量染砷组血清HA、PCⅢ、LN高于中剂量染砷组(P均＜ 0.05).iTRAQ技术结合2DLC-MS/MS技术选取蛋白质的置信阈值(unused protScore)＞1.3,且至少有1条匹配肽段在95％置信区间内作为蛋白质鉴定结果,鉴定出2 948种蛋白质.文氏图比较发现对照组和中、高剂量染砷组均检测到2 162种蛋白,除去对照组中有意义的差异蛋白,中剂量染砷组上调蛋白为687种,下调为548种;高剂量染砷组上调为633种,下调为519种.中、高剂量染砷组表达差异蛋白数量比较,差异无统计学意义(P＞0.05).与甲基代谢相关的差异蛋白砷甲基转移酶(AS3MT)、蛋氨酸腺苷转移酶(MAT)、丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)、甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶(BHMT),线粒体内胆碱脱氢酶(CHDH)、胱硫醚酶(CTH)、半胱氨酸脱羧酶(CSAD),在中、高剂量染砷组均上调;甲硫氨酸合成酶(MTR)有2种蛋白,其中METK1上调,F1LRB8下调.与谷胱甘肽(GSH)相关蛋白18种,包括Gsta1、Gsta4、Gsta5、Gstt1、Gstt2、Gstk1、Gstp1、Gstm1、Gstm2、Gstm3,Gss、Gpx1、Gpx4 、Esd、Hagh、Glo1、Mgst1、B6DYQ5,表达均上调;与肝纤维化有关的蛋白有Hic-5、谷氨酰胺合成酶(GSS)、原肌球蛋白(Tpm),其中Tpm有6种,包括Tpm1三种、Tpm2两种、Tpm3一种,表达均上调.结论 慢性砷暴露后导致肝脏纤维化改变,肝纤维化大鼠AS3MT、MTR、MAT、SHMT、BHMT、CHDH、CTH、CSAD、Hic-5、GSH、GSS、Tpm高表达,可能在砷代谢和肝纤维化中发挥重要作用,与肝纤维化的发生相关.
关键词： 砷代谢 肝纤维化 蛋白组学 相对和绝对定量同位素标记
