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肝豆汤改良方对Wilson's病模型TX乳鼠神经元内Cyt C/Caspase信号通路的分子调控机制
目的:探讨肝豆汤改良方调控TX乳鼠神经元内细胞色素C(Cyt C)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)信号通路的分子靶点并观察其相应的调控机制.方法:本实验乳鼠神经元通过原代方法分离培养所得,分为正常组、模型组、肝豆汤改良方组、丁苯酞组,正常组为正常DL乳鼠神经元,用完全培养基培养,模型组为TX乳鼠神经元,用10％空白兔血清培养,肝豆汤改良方组为TX乳鼠神经元,加入含体积浓度(5％,10％,15％,20％)肝豆汤改良方兔血清的培养基继续培养,丁苯酞组为TX乳鼠神经元,用10％含丁苯酞兔血清培养.采用原子吸收分光光度法检测不同浓度含肝豆汤改良方兔血清作用24 h后,对TX乳鼠神经元内微量元素的影响;流式细胞仪检测经肝豆汤改良方兔血清作用后活性氧(ROS)释放量的变化;蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测经含肝豆汤改良方兔血清作用后Cyt C,Caspase-9,Caspase-3蛋白的表达.结果:与模型组比较,含肝豆汤改良方兔血清可显著降低TX乳鼠神经元内铜、铁含量,增加锌含量(P＜0.01).流式细胞仪检测发现,含肝豆汤改良方兔血清较模型组可显著降低TX乳鼠神经元内ROS的释放量(P＜0.01).Western blot检测结果显示与模型组比较,含肝豆汤改良方兔血清可显著降低TX乳鼠神经元内Cyt C,Caspase-9,Caspase-3蛋白表达(P＜0.01).结论:肝豆汤改良方可能是通过促进过量铜排出而抑制神经元内Cyt C,Caspase-9,Caspase-3表达,从而减轻高铜对神经元的损伤作用.肝豆汤改良方可通过减少脑内铜含量,进而调控Cyt C/Caspase信号通路达到减轻高铜诱导的神经元损伤的治疗效果.
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肝豆汤改良方对TX小鼠脑组织ASM、Cer及p38MAPK mRNA和蛋白表达的影响
目的:探讨肝豆汤改良方(MGDD)对TX小鼠脑组织酸性鞘磷脂水解酶(ASM)、神经酰胺(Cer)及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK) mRNA和蛋白表达的影响.方法:将140只TX小鼠随机分成1、3、5月龄模型组,3、5月龄MGDD组及3、5月龄丁苯酞组,每组20只,同时选用相同月龄60只DL小鼠分别为1、3、5月龄正常对照组,每组20只,饲养环境及喂食食物相同,均从入组时开始给药,MGDD治疗组按24.5g·kg-1·d-1灌胃,丁苯酞组给以丁苯酞混悬液0.156g·kg-1·d-1灌胃,正常对照组及模型组灌胃100mL·kg-1·d-10.9％氯化钠溶液,1次/d,收集处理标本,采用RT-PCR、免疫组织化学法及Wcstern blot技术检测脑组织内ASM、Cer及p38 MAPKmRNA及蛋白表达水平.结果:模型组小鼠脑组织ASM、Cer及p38 MAPK mRNA及蛋白表达程度伴随着月龄的增加,表达有增多趋势,MGDD治疗组较模型组可显著降低小鼠脑内ASM、Cer及p38 MAPK mRNA及蛋白表达水平(P＜0.05,P＜0.01),且随着疗程的延长,抑制更加显著.结论:MGDD可能通过下调小鼠脑组织神经酰胺信号通路中ASM、Cer、p38 MAPK mRNA及蛋白的表达水平,改善铜负荷引起的神经元损伤.
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肝豆汤改良方对TX小鼠脑组织XIAP、Caspase-9和Caspase-3蛋白及其mRNA表达的影响
目的 探究肝豆汤改良方抑制肝豆状核变性(Wilson's disease,WD)脑神经细胞凋亡的分子机制.方法 选取1月龄TX小鼠120只,随机分为TX模型组(40只)、肝豆汤改良方组(40只)、丁苯酞组(20只),另选DL小鼠40只作为正常组;每组再分成2组,各20只,分别予以生理盐水、肝豆汤改良方、丁苯酞灌胃2个月和4个月.分别采用免疫组织化学法和Western blot法检测小鼠脑组织中X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)、胱冬肽酶-9(Caspase-9)及胱冬肽酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平,采用RT-PCR技术检测小鼠脑组织中XIAP、Caspase-9及Caspase-3 mRNA表达水平.结果 免疫组织化学检测显示,肝豆汤改良方组XIAP表达水平较同月龄模型组明显增多,Caspase-9和Caspase-3表达水平较同月龄模型组下降,5月龄和3月龄肝豆汤改良方组XIAP和Caspase-3表达水平有所差异.Western blot检测结果显示,月龄因素对脑组织XIAP、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达水平的主效应均无统计学意义(P＞0.05);月龄因素和分组因素对3种蛋白表达水平的交互作用均无统计学意义(P＞0.05);对于同月龄小鼠,模型组脑组织XIAP表达水平显著低于正常组(P＜0.05),Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平显著高于正常组(P＜0.05);肝豆汤改良方组XIAP表达水平显著高于模型组(P＜0.05),Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平显著低于模型组(P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,月龄因素对小鼠脑组织XIAP mRNA表达水平的主效应无统计学意义(P＞0.05),但对Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达水平的主效应具有统计学意义(P＜0.05);月龄因素和分组因素对XIAP、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达水平的交互作用均无统计学意义(P＞0.05).对于相同月龄小鼠,模型组脑组织XIAP mRNA表达水平显著低于正常组(P＜0.05),而Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达水平显著高于正常组(P＜0.05);与模型组比较,丁苯酞组和肝豆汤改良方组XIAP mRNA表达水平显著升高(P＜0.05),Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达水平显著降低(P＜0.05).结论 肝豆汤改良方通过上调XIAP蛋白及其mRNA的表达,下调Caspase-9、Caspase-3蛋白及其mRNA在脑组织中的表达,减轻铜沉积对神经细胞的氧化应激损伤,从而抑制神经细胞的凋亡.
