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小鼠肝炎病毒N蛋白间接ELISA方法的建立
目的 运用重组蛋白作为包被抗原建立检测小鼠肝炎病毒抗体的间接ELISA方法.方法 将大肠杆菌表达小鼠肝炎病毒核衣壳蛋白(Nucleocapsid N)的主要抗原域NP(S)纯化后作为诊断抗原,通过条件优化,建立检测小鼠肝炎病毒抗体的间接ELISA方法.结果 确定其包被抗原的浓度为300 ng/mL,血清稀释度为1:200,山羊抗小鼠酶标抗体的稀释浓度为1:3000.S/P≥0.386则为阳性,S/P<0.308为阴性,两者之间为可疑.经阻断试验、交叉试验和重复性实验,表明该方法特异性强,重复性好.与国家实验动物检测中心的MHV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较,特异性、敏感性和符合率分别为94.1%、93.3%和93.9%.用该融合蛋白包被聚苯乙烯板后在-20℃下可保存5个月,应用该方法检测了98份送检的血清样品,有10份检测为阳性.结论 本研究建立的间接ELISA特异性强,重复性好,为进一步开发MHV血清抗体诊断试剂盒奠定了基础.
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羟基红花黄色素A人工抗原的制备
目的 研究羟基红花黄色素A(HSYA)与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)的偶联方法,获得具有免疫原性的羟基红花黄色素A人工抗原.方法 通过偶联物透析液的颜色变化、紫外图谱、红外扫描图谱及动物免疫试验来鉴定制备的人工抗原.结果 HSYA-BSA人工抗原在紫外扫描中表现出HSYA和BSA的特征吸收峰;在红外扫描中HSYA-BSA具有HSYA特征官能团的吸收峰和氨基酸的特征吸收峰;间接ELISA检测结果显示产生抗HSYA的特异性抗体,血清效价可达1 : 3 200;标准曲线方程计算得BSA和HSYA的结合率是1:50.结论 通过直接偶联法成功制备出具有免疫原性的羟基红花黄色素A人工抗原.
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间接ELISA 法检测儿童血清MenC PS抗体水平
C群脑膜炎奈瑟菌所致流行性脑脊髓膜炎病情较为危重,患者发病急骤,病情进展迅速,病死率高,而且很容易出现局部爆发流行,对人类健康造成极其严重的危害.近些年C群流脑在我国广西、安徽等地出现多次爆发流行[1],故其诊断和预防引起了学者的高度重视.为此,我们建立了抗C群荚膜多糖IgG抗体的间接ELISA法,并对385名儿童抗体水平进行了检测,旨在为流脑的防治工作提供相关依据.
关键词： 间接ELISA 抗C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖IgG抗体 检测 -
短时低速离心法在酶联免疫（ELISA）中代替传统手拍板的可行性研究
目的：探讨短时低速离心法在酶联免疫吸附测定（ELISA）中代替传统拍板的可行性。方法：采用间接ELISA，7例样本设置副孔，一组采用短时低速离心法，一组采用传统手拍板，传统手拍组两个96孔板，短时低速离心组四个96孔板，每板样本相同。结果：采用短时低速离心可以在相同时间内完成四个96孔板操作，而传统手拍板只能完成两块96孔板操作。通过独立样本t检验分析比较两组吸光度值，短时低速离心组同一样本终检测均值与传统手拍板组之间差异无统计学意义（P＞0.05），两种方法检测效果相差不大，但终检测值稳定性比传统手拍板组更高。结论：采用短时低速离心法更为简单易行，操作稳定，对于间接ELISA检测大批量样本来说，可节省至少一倍时间。
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金黄色葡萄球菌肠毒素C3单克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备稳定分泌抗金黄色葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的性质进行鉴定.方法 以SEC3重组蛋白免疫Balb/c小鼠,应用细胞融合技术将小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA法检测筛选及2次有限稀释法克隆化培养,获得目的杂交瘤细胞株,并对其所产生的单克隆抗体进行效价、亲和常数及抗原识别表位等相关性质的鉴定.结果 终获得了两株能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞1C12和2A2,两者细胞培养上清的效价分别为1∶3 200和1∶1 600.经分析可知1C12细胞株的亲和力高于2A2细胞株,同时相加实验表明两个单克隆抗体识别抗原表位相同.结论 单克隆抗体制备成功,为进一步完善肠毒素SEC3的临床检测奠定了基础.
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建立一种用重组蛋白检测抗口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法
目的:研究以重组蛋白作为包被抗原检测口蹄疫病毒(FMDV)感染后的动物血清中特异性抗体的可能性,为建立一种非病毒颗粒的ELISA检测试剂盒提供实验依据.方法:利用自行构建表达的O型口蹄疫病毒VP1表位肽重组蛋白(VP1epi)作为包被抗原,采用间接ELISA方法确定抗原的佳工作浓度和包被方法,优化各项实验条件,并以FMDV感染后的豚鼠血清作为标准阳性血清确定ELISA方法的特异性和灵敏度.结果:FMDV感染后的阳性豚鼠血清可以很好地识别VP1epi重组蛋白,用此蛋白包被检测抗FMDV抗体的灵敏度可达1∶3 200,并证明所检测的抗体是FMDV特异性的.结论:VP1epi重组蛋白可以替代FMDV颗粒用于建立检测抗FMDV抗体的ELISA试剂盒.
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Survivin蛋白的原核表达及在肿瘤诊断中的初步应用研究
目的 实现Survivin蛋白在大肠杆菌BL21中的可溶性表达,建立基于Survivin蛋白的Survivin抗体检测方法,为survivin的深入研究及肿瘤的早期诊断奠定基础.方法 从食管癌细胞Eca109中提取RNA,经RT-PCR扩增,克隆出Survivin基因;用PCR将Survivin克隆至载体pET32a(+);用双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定;IPTG诱导Survivin蛋白表达,用镍离子亲和层析纯化,ELISA及Western blot鉴定;建立基于重组融合蛋白的Survivin抗体检测方法,并对肿瘤和癌前病变患者血清进行检测.结果 构建了Survivin蛋白原核表达载体pET32a(+)/Survivin/BL21,实现了Survivin蛋白在大肠杆菌BL21中的可溶性表达;建立了检测Survivin特异性抗体的间接ELISA,对44份健康血清、142份肿瘤患者血清、186份癌前病变患者血清进行了检测,结果显示:anti-Survivin在肿瘤患者中的检出率为32%,特异性为88%;anti-Sunrvivin阳性率与年龄和性别无关(P＞1.0,P＞0.912);在69例消化系统肿瘤中,血清anti-Survivin阳性率32%;186例癌前病变患者anti-survivin阳性率31.7%,AFP和CEA阳性率分别为10.8%和16.7%(χ2=28.0705,P＜0.005);在消化性溃疡患者,anti-survivin和CEA阳性率均为33.3%;在直肠息肉中anti-survivin阳性率33.3%,CEA阳性率仅为5.6%(χ2=34.309,P＜0.005);在慢性结肠炎患者,anti-survivin阳性率40%,CEA阳性率20%(χ2=13.41,P＜0.005).结论 本研究获得的Survivin蛋白和建立的Survivin抗体检测方法,为survivin作为肿瘤标志物的深入研究奠定了重要基础.
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牛布氏杆菌特异性抗体间接ELISA检测方法的建立及应用
目的 建立牛布氏杆菌特异性抗体间接ELISA检测方法 ,并进行初步应用.方法 用大肠杆菌表达的牛布氏杆菌重组BP26蛋白作为检测抗原,用棋盘滴定法确定包被抗原和待检血清的佳工作浓度,对各种反应条件进行优化,建立间接ELISA方法 ,并进行验证.采用建立的间接ELISA方法 与传统的试管凝集试验同时检测116份血清样品,评价二者的符合率.结果 间接ELISA的佳反应条件为:抗原包被量5 μg/孔;待检血清稀释倍数1:200.作用时间60 min;酶标二抗作用时间60 min;封闭液为5%BSA,作用时间45 min.S/P值≥0.363者判为阳性,S/P值≤0.291者判为阴性,介二两者之间判为可疑.该方法 精密性良好,特异性较强.敏感性较高,与传统的试管凝集试验检测结果 的符合率为93.3%.结论 已成功建立了检测牛布氏杆菌特异性抗体的间接ELISA方法 .为布氏杆菌病的流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.
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D2蛋白酶间接ELISA检测方法的建立
目的 建立D2蛋白酶间接ELISA检测方法,为D2蛋白酶的进一步研究及应用奠定基础.方法 以纯化的D2蛋白酶为抗原,免疫新西兰白兔,制备D2蛋白酶多克隆抗体,建立D2蛋白酶间接ELISA检测方法,并进行验证及初步应用.结果 D2蛋白酶间接ELISA检测方法的佳反应条件为:一抗稀释度为1:64 000,二抗稀释度为1:80 000,抗原稀释度为1:100,饱和包被浓度为1 160 ng/ml,封闭剂为10%胎牛血清.标准曲线的线性检测范围为18～1 160 ng/ml.该方法准确性、重复性良好,特异性强、敏感性高,与琼脂扩散试验检测结果的符合率为95.5%.结论 已建立了D2蛋白酶间接ELISA检测方法,可用于D2蛋白酶含量的检测.
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人血清中抗鼠抗体间接ELISA检测方法的建立及临床应用
目的 建立检测人血清中抗鼠抗体(HAMA)的间接ELISA法,并进行临床标本检测.方法 采用间接ELISA法,选择佳实验条件,确定阴阳性血清判定的界值,并进行方法学验证;用该方法检测WuTac Ⅰ期临床观察的健康志愿者血清抗鼠抗体.结果 间接ELISA的佳试验条件为:抗原包被浓度0.313 μg/ml,血清稀释度1:160,酶标抗体稀释度1:80 000;阴阳性血清界值为0.210;该方法检测HAMA阳性标本的试验内和试验间变异系数分别为7.46%和5.48%,检测HAMA阴性标本的试验内和试验问变异系数分别为8.03%和14.7%;与马、山羊、兔、猴等动物血清尤交叉反应;健康志愿者HAMA约在用药后10～14 d产生.结论 已成功建立了检测人血清中抗鼠抗体的间接ELISA法,符合我国生物药品临床试验检测的要求.
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羊布鲁菌膜蛋白的提取及血清抗体间接ELISA检测方法的建立
目的 提取羊布鲁菌标准强毒株16 m膜蛋白,分析其反应原性,并建立血清抗体间接ELISA检测方法.方法 利用碳酸盐方法提取羊布鲁菌标准强毒株16 m膜蛋白,12%SDS-PAGE分析其相对分子质量范嗣;用自然感染羊布鲁菌的阳性血清进行Western blot分析,初步确定膜蛋白组分中能够发生免疫反应的条带;用方阵滴定法确定抗原和抗体的佳稀释度,建立间接ELISA检测方法,并进行特异性和精密性验证;检测免疫豚鼠的血清抗体效价;对临床上采集的羊血清样品进行检测,并与虎红平板凝集试验结果进行比较.结果 分离的羊布鲁菌膜蛋白浓度为9.4 μg/μl;SDS-PAGE分析显示,羊布鲁菌膜蛋白的相对分子质量主要集中在17 000～80 000之间;Western blot分析显示多条特异性反应条带.膜蛋白抗原的佳稀释度为1:1 280,抗体佳稀释度为1:10.所建立的ELISA方法特异性和精密性良好.ELISA检测豚鼠血清效价为1:64 000.检测临床510份羊血清样品,阳性率为86.3%,高于虎红平板凝集试验检出的阳性率(41.2%).结论 已成功提取了羊布鲁菌膜蛋白,其具有良好的反应原性,并建立了血清抗体间接ELISA检测方法.
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PfCP-2.9/PfCSP-2疟疾联合疫苗免疫效果血清学评价研究
目的：对PfCP-2.9/PfCSP-2疟疾联合疫苗所诱发的特异性IgG抗体进行分析评价。方法将5只新西兰白兔分为两组，其中免疫组3只，非免疫组2只。免疫组接种PfCP-2.9/PfCSP-2疟疾联合疫苗，非免疫组注射生理盐水。连续3次免疫后，采集血液样本并经间接ELISA检测其IgG抗体水平。根据非免疫组兔的吸光度数值（A值）计算临界值。临界值=2.1×非疫苗免疫组兔A值均值。若免疫组兔吸光度值高于临界值，则被判定为疫苗可诱发特异性 IgG 抗体。结果疫苗可诱发针对PfCP-2.9和PfCSP-2重组蛋白IgG抗体，经4个稀释浓度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800）检测获得2只免疫组兔A值分别为0.629/0.544、0.548/0.443、0.479/0.378、0.410/0.281，均高于相应稀释浓度的临界值（0.019、0.017、0.016、0.020）；疫苗可诱发针对 PfCSP 的特异性 IgG 抗体（每孔包被4μg/ml 多肽），经4个稀释浓度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800）检测2只免疫组家兔A 值分别为0.308/0.152、0.194/0.080、0.110/0.040、0.060/0.025，均高于相应稀释浓度的临界值（0.027、0.019、0.018、0.018）；疫苗可诱发针对PfCSP的特异性IgG抗体（每孔包被10μg/ml多肽），经4个稀释浓度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800）检测获得2只免疫组家兔 A 值分别为0.333/0.129、0.221/0.086、0.133/0.048、0.075/0.029，均高于相应稀释浓度的临界值（0.048、0.038、0.036、0.036）；结论 PfCP-2.9/PfCSP-2疟疾联合疫苗可诱发高水平IgG抗体，该疫苗是安全、有效且耐受性良好。
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以重组蛋白为抗原的ELISA法检测旋毛虫抗体
目的寻求特异性强、敏感性高的旋毛虫病诊断抗原.方法以旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因在E.coli高效表达的重组蛋白为抗原,分别以兔、猪和健康者血清及旋毛虫病阳性血清为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、山羊抗猪IgG和山羊抗人IgG为二抗,建立检测旋毛虫抗体的间接ELISA方法,并以旋毛虫肌幼虫排泄-分泌(ES)抗原作为检测对照.结果以T668重组蛋白为抗原,对兔、猪和人旋毛虫病血清进行检测,阳性检出率为100%,且敏感性高(0.016μg/孔),与ES抗原检测结果完全一致.结论T668重组抗原有望替代ES抗原检测旋毛虫抗体.
关键词： 旋毛虫 重组蛋白 新生幼虫期特异性基因 间接ELISA -
梅毒螺旋体Tp 0319重组蛋白的表达、纯化及其在临床诊断中的初步应用
目的 克隆、表达及纯化梅毒螺旋体(Tp)外膜蛋白Tp 0319,并建立间接ELISA方法,探讨其在梅毒血清学诊断中的价值.方法 构建重组质粒PQE32/Tp 0319,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和western blot鉴定表达结果;Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,间接ELISA检测梅毒患者血清中特异性IgG抗体.结果 成功构建了PQE32/Tp 0319重组质粒;经SDS-PAGE检测,诱导产物显示有一条相对分子质量约为30 000的特异蛋白质条带,western blot分析证明其只与人抗Tp IgG发生特异性反应;将Tp 0139用于间接ELISA检测抗Tp抗体阴、阳性参比血清,特异性和敏感性均为100%;检测梅毒患者和健康献血者血清各150份,结果与TPPA法符合率为95.3%.结论 制备的Tp 0319重组蛋白有较好的免疫反应性,可望用于临床梅毒血清学诊断.
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三种方法联合检测对SARS的诊断意义分析
目前用于SARS病原学检测的方法主要有血清学和分子生物学方法.本文就巢式RT-PCR检测SARS病毒RNA和两种ELISA法检测特异性抗体情况进行分析.
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光密度值标准化软件研制及若干问题探讨
目的 针对间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测日本血吸虫感染结果标准化中的几个常见问题,开发一款光密度值标准化软件,规范标准化过程和结果.方法 以改良光密度值标准化变换方法(I-STOD)为开发依据,以Matlab GUI为开发工具,综合I-STOD实施过程中的各个环节以及相应的处理方法进行软件开发,并用来自日本血吸虫病疫区的血清检测结果对该软件进行测试.结果 成功开发了用于标准化光密度值的软件-I-STOD V1.0.该软件的运行环境为WIN-DOWS XP/WIN 7,所需硬盘容量约0.5 GB.用来自日本血吸虫病疫区的血清检测结果对该软件测试表明,该软件有针对性地解决了标准化过程中的标准曲线可靠性判断、样本适用范围及超范围样本稀释度确定等问题,使得I-STOD在应用上更简便、在操作上更规范.结论 基于I-STOD方法开发的I-STOD V1.0应用软件操作简便,且能有效地对间接ELISA法的实验结果进行标准化.
关键词： 日本血吸虫病 间接ELISA 标准化 I-STOD V1.0软件 I-STOD -
日本血吸虫尾蚴经不同途径和方式感染的研究
目的探讨尾蚴经IMDM悬液皮下注射和肌肉注射感染动物建立动物模型的可行性.方法22只昆明小鼠随机分为3组:A组经IMDM悬液皮下注射感染尾蚴,B组经IMDM悬液肌肉注射感染尾蚴,C组经典玻片贴皮感染尾蚴.45 d后剖杀检查成虫数目,并用间接ELISA法测定小鼠感染后第15、45天体内的抗血吸虫IgG抗体水平.结果45 d杀鼠后,A组成虫回收率为39.2%(P＜0.05),B组为32.3%(P＜0.05),C组为72.8%.感染后第45天A、B两组与C组小鼠体内IgG水平差异无显著性(P＞0.05).结论尾蚴经皮下、肌肉注射感染小鼠成功,其感染率均为100%.但与经典玻片贴皮感染动物在回收率方面仍有一定差距.
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重组蝎毒抗神经兴奋肽的ELISA分析方法建立及稳定性的初步研究
目的 建立重组蝎毒抗神经兴奋肽(ANEP)的ELISA分析方法并对ANEP的稳定性进行初步研究.方法 以分别建立的间接ELISA和间接竞争ELISA分析方法进行ANEP含量测定,并通过方法学的优化,终以建立的间接法ELISA方法测定了温度、pH值、反复冻融、超声对A NEP稳定性的影响.结果 间接ELISA相对于间接竞争ELISA有着更好的线性关系和灵敏度,线性范围0.025～1.60 μg/mL.检测限为10 ng/mL.稳定性实验表明ANEP在37,60℃的条件下放置24 h含量基本不变,pH 5～11的缓冲液中保持稳定,反复冻融、超声4 min后含量降低.结论 所建立的间接ELISA方法能很好的用于ANEP的测定.ANEP的热稳定性较好,强酸性下不稳定,对反复冻融与超声等稳定性较差.
关键词： 重组蝎毒抗神经兴奋肽 酶联免疫吸附法 间接ELISA 间接竞争ELISA 稳定性 -
牛乳中抗幽门螺杆菌特异性抗体的间接ELISA法的建立
目的 建立抗幽门螺杆菌(Hp)特异性抗体的ELISA检测方法,用于牛乳中抗Hp特异性抗体的检测.方法 超声Hp全菌抗原接种奶牛,按多克隆抗体制备技术制备牛抗Hp抗血清.用纯化牛IgG免疫家兔.制备兔抗牛IgG多克隆抗体.硫酸铵盐析,DEAE-32柱层析分别纯化牛与兔IgG.兔抗牛IgG以辣根过氧化物酶标记.用Hp全菌抗原包被反应板,建立间接ELISA法用于牛乳抗Hp抗体的检测.结果 建立的抗Hp间接ELISA法的佳包被抗原量为1.47μg/孔,HRP-兔抗牛IgG 1∶600稀释,标准曲线方程为A=0.0124+0.3988 lnC,相关系数r=0.999 8,线性范围为1.8～145μg/ml,回收宰在86.4%～92.8%,变异系数为9.4%～12.3%.结论 初步建立牛乳中抗Hp抗体的间接ELISA测定法,可用于Hp免疫牛乳中抗Hp特异性IgG的检测.
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日本斑点热立克次体近缘株重组OmpB蛋白抗原性研究
目的 探讨关于斑点热立克次体的临床诊断及流行病学调查而进行的诊断方法学研究.方法 构建R.Japonica Anhui 120 strain OmpB原核表达质粒,表达、鉴定并纯化重组蛋白,用其作为抗原建立间接ELISA检测方法,检测120份临床样本中日本斑点热立克次体特异性IgG抗体,并评价方法的敏感性和特异性.结果 获得了高表达、高纯度的OmpB重组蛋白,建立的间接ELISA方法体系与美国食品和药物管理局认可的诊断试剂盒相比有良好的特异性和敏感性,两者的特异性为100％,敏感性为96.7％,符合率为99.2％,Kappa值为0.98.结论 OmpB重组蛋白具有很好的免疫反应性,能特异地检出斑点热立克次体IgG抗体,间接ELISA方法可作为临床诊断的技术储备及流行病调查和科学研究.
