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噬菌体展示技术筛选人乳腺髓样癌细胞特异性结合肽
目的 利用噬菌体随机七肽库体外筛选与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞特异性结合的小分子多肽. 方法 培养人乳腺髓样癌Bcap-37细胞作为靶细胞,人正常乳腺上皮细胞MCF-10A为吸附细胞,将噬菌体展示随机七肽库与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞进行减性体外筛选,用ELISA法鉴定噬菌体对人乳腺癌Bcap-37细胞的亲和力.提取亲和力较高的单克隆噬菌体DNA,测定DNA序列并翻译出相应的氨基酸序列,进行同源性分析. 结果 利用噬菌体随机七肽库通过4轮减性筛选获得了与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞特异结合的小分子多肽.ELISA法表明,第1,3,5,6,8,12,14,16,17,18和20号单克隆噬菌体与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞有很强的亲和力和特异性.测序结果显示,重复性高的序列为LXRNTNX. 结论 利用噬菌体展示技术体外筛选获得了能与人乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的小分子多肽LXRNTNX,经检索该肽段与已知蛋白尚无同源性,因此它很有可能成为乳腺癌的早期诊断和靶向治疗新的靶点.
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触减PCR在扩增抗体重链和轻链可变区中的应用
目的 探讨扩增人免疫球蛋白重链和轻链可变区基因的方法. 方法 提取经免疫的具有乙肝表面抗体的人外周血淋巴细胞总RNA,反转录合成cDNA,采用普通PCR和触减PCR两种方法扩增抗体重链和轻链可变区基因. 结果 利用触减PCR方法,扩增出抗体重链和轻链的可变区基因,基因片段分别约为340 bp和325 bp,而普通PCR没有得到预期的结果. 结论触减PCR比普通PCR更容易扩增出抗体可变区基因片段.
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乙肝病毒核心抗原人源单链可变区抗体的筛选
目的筛选、鉴定乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)蛋白的人源单链可变区抗体(ScFv)的编码基因,为细胞内表达小分子单链抗体的研究及抗HBV的基因治疗研究奠定基础.方法采用噬菌体表面展示技术,以HBcAg蛋白为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得抗原结合活性较强的HBcAg人源单链可变区抗体阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定.结果筛选得到的ScFv片段编码基因为771nt,编码的产物由257个氨基酸残基组成,具有典型的轻链和重链可变区结构特点以及与HBcAg结合的特异性.结论利用噬菌体抗体库技术成功地获得了HBcAg人源单链可变区抗体的编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达.
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采用噬菌体展示技术筛选肠致病性大肠埃希菌EspB蛋白结合短肽的实验研究
目的 探讨是否能够通过噬菌体展示技术筛选与肠致病性大肠埃希菌(EPEC)关键蛋白EspB结合的短肽.方法 采用体外大肠埃希菌中表达和纯化EspB蛋白情况,Western blot验证蛋白的表达;Ph.D.12-蛋氨酸噬菌体展示技术用来筛选EspB特异结合蛋白;ELISA方法用来鉴定这些特异性结合蛋白与EspB的亲和力.结果 Western blot验证从pET21 b-EspB转染质粒中提取的EspB蛋白.噬菌体展示技术筛选出了噬菌体6、7、8、12候选蛋白,ELISA检测结果显示这些候选蛋白与EspB蛋白的亲和力高于对照蛋白.结论 我们的数据提供了一种潜在的研究策略即通过靶向结合EspB蛋白可抑制EPEC对上皮细胞的粘附.
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抗人B-淋巴细胞刺激因子噬菌体单链抗体库的构建
目的 构建抗人B-淋巴细胞刺激因子噬菌体单链抗体库.方法 从B-淋巴细胞刺激因子免疫小鼠的脾细胞中抽提总RNA,经逆转录聚合酶反应合成cDNA,分别扩增小鼠重链可变区基因和轻链可变区基因.通过重叠延伸拼接法将重链可变区基因和轻链可变区基因组装成单链抗体基因,重组于载体pFUSE5,电转化E.coli XL1-Blue.在辅助噬菌体援救下,构建成噬菌体单链抗体库.采用聚合酶链反应、核苷酸序列测定和酶联免疫分析鉴定单链抗体库的特征.结果 本抗体库的噬菌体库容量约1×106,单链抗体基因插入效率为93%,存在序列差异性并含有抗B-淋巴细胞刺激因子单链抗体.结论 成功地构建了抗人B-淋巴细胞刺激因子单链噬菌体抗体库,为筛选抗B-淋巴细胞刺激因子单链抗体药物奠定了良好的基础.
关键词： 人B-淋巴细胞刺激因子 单链抗体 噬菌体展示技术 聚合酶链反应 -
试用ICAM-1相关小分子肽抑制角朊细胞介导的共刺激效应
目的:探讨ICAM-1相关肽抑制角朊细胞将超抗原TSST-1递呈给T淋巴细胞.方法:应用鼠抗人CD54单克隆抗体筛选噬菌体随机十五肽库,经4轮筛选后,挑取20个克隆进行测序,利用含保守序列的阳性克隆噬菌体对角朊细胞递呈超抗原TSST-1给T细胞进行阻断试验.结果:得到保守序列为ITRSFQSSMEPGPPG,所筛选的阳性噬菌体克隆与野生型噬菌体相比具有明显的阻断效应(P＜0.01).结论:ICAM-1相关小分子肽可望降低超抗原介导的皮肤炎症反应.
关键词： 噬菌体展示技术 细胞间粘附分子-1 超抗原 中毒性休克综合征毒素-1 角朊细胞 -
利用体内噬菌体展示技术筛选膀胱癌特异性结合肽
目的：利用体内噬菌体展示技术筛选与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽。方法：将人膀胱移行细胞癌细胞BIU87接种于裸鼠体内，制备膀胱癌荷瘤小鼠模型，尾静脉注射噬菌体展示环七肽库，然后筛选与膀胱移行细胞癌特异性结合的含外源多肽的噬菌体，经过3轮体内筛选后，免疫组织化学法及ELISA法鉴定单克隆噬菌体对BIU87的亲和力。提取阳性单克隆噬菌体单链DNA进行测序，并推导出外源多肽氨基酸序列，化学合成多肽、制备分子探针后采用激光扫描共聚焦显微镜术及流式细胞术鉴定多肽对膀胱癌细胞和组织的特异性。结果：3轮体内筛选后，噬菌体富集率达到4．334×102倍。免疫组化结果显示，肿瘤组织中噬菌体肽的含量随着每一轮筛选呈增长趋势，且结合逐渐增强，同时由于噬菌体经肝、肾代谢，可见肝脏结合大量非特异性的噬菌体。 ELISA结果显示，随机挑选的30个单克隆噬菌体斑中，有24个阳性噬菌体，其中10个噬菌体对BIU87有较强的亲和力，对其测序并推导出3种多肽序列，重复率高的序列CSSPIGRHC（8／10）命名为NYZL1。化学合成FITC－C6－NYZL1，通过激光扫描共聚焦显微镜术、流式细胞术均证明多肽NYZL1可以特异性结合膀胱癌细胞。结论：利用体内噬菌体展示技术筛选出了与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽NYZL1，为膀胱癌早期诊断和靶向治疗提供一定的理论依据。
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COMP特异性单抗15 A11的表位特征研究
目的：鉴定RA相关自身抗原COMP的一株特异性单克隆抗体15A11的表位特征。方法：选用随机十二肽噬菌体库对mAb 15A11进行三轮筛选，随机挑取40个单噬菌斑，提取DNA，测序；ELISA检测每个噬菌体克隆与mAb 15A11结合的特异性；通过ClustalW2对特异性结合的噬菌体展示的十二肽和COMP进行氨基酸序列比对，PyMOL分析一致氨基酸所在肽链的二级结构及表位氨基酸之间的距离，初步确定mAb 15A11的表位；变性和非变性Western blot、EDTA螯合Ca2＋后ELISA分析以及合成多肽的ELISA实验进一步确定表位序列。结果：得到的40个测序噬菌体中，共有5个噬菌体克隆，ELISA确定克隆1和克隆2与mAb 15A11特异性结合，其他克隆均为非特异性结合的噬菌体；氨基酸序列比对，在COMP上未发现与克隆1和克隆2噬菌体相同的连续氨基酸序列，提示mAb 15A11的抗原表位可能为非线性表位；PyMOL分析表位氨基酸在COMP上的定位及距离，显示构象表位的合理性；变性Western blot分析为阴性，而非变性Western blot条件下为阳性；EDTA螯合Ca2＋破坏COMP的构象后不能与mAb 15A11结合，而未经处理的与mAb 15A11结合，均说明mAb 15A11表位是构象表位；合成多肽与mAb 15A11的ELISA结果进一步确定了mAb 15A11的构象表位序列。结论：鉴定了mAb 15A11的表位是构象表位序列，且确定了该构象表位的氨基酸组成，为研究COMP抗体与抗原反应机制具有重要理论价值，并对类风湿性关节炎的检测有重要应用意义。
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噬菌体展示技术的研究进展
噬菌体展示技术是将外源蛋白通过与丝状噬菌体外壳蛋白融合而表达于噬菌体颗粒表面,被展示的外源多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性.近有实验表明噬菌体表面展示的外源多肽模拟了天然抗原的空间结构,利用筛选肽库的方法确定抗原的线性和构象型表位是可行的.这对于发现与疾病相关的抗原表位具有一定的普遍意义,有可能在未知的情况下进行疫苗及诊断分子的设计.
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人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库的构建及筛选
目的 构建人源抗狂犬病病毒单链抗体(Single-chain fragment variable,scFv)噬菌体抗体库,并进行筛选.方法 以接种过狂犬病疫苗的21份高效价的健康人外周血为原料,提取淋巴细胞总RNA,PCR扩增VH、Vκ、Vλ基因,重叠延伸PCR扩增获得scFv基因,克隆入噬菌粒pS100,电转化E.coli TG1,建立scFv初级抗体库,并进行基因序列分析及鉴定.以灭活的狂犬病病毒为抗原,进行3轮scFv噬菌体抗体库的富集筛选,随机挑取单克隆,制备噬菌体抗体颗粒,并进行ELISA分析,阳性克隆进行序列分析,采用快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent facus inhibition test,RFFIT)检测噬菌体抗体颗粒的中和活性.结果 获得了库容为1.7×108的人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,该抗体库具有较好的序列正确率和多样性,经3轮筛选后,ELISA分析显示,共获得24个序列各不相同的针对狂犬病病毒的阳性克隆,对其中7个克隆的噬菌体抗体颗粒进行RFFIT检测,均具有中和活性.结论 已成功构建了人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,并建立了筛选方法.
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噬菌体展示技术与肽疫苗的设计
近年来,噬菌体肽库的构建及筛选技术得到迅速发展和推广,现已广泛应用于基因定位、分子识别、疫苗设计等相关领域,尤其在非常规疫苗设计方面具有巨大的潜力.该疫苗设计策略是在分子免疫学抗原呈递的机制研究基础上提出的,具有安全、分子小、周期短、特异性高、易于大规模制备等特点,可以代替传统疫苗.本文就噬菌体展示技术用于肽疫苗设计的原理及前景作一综述.
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噬菌体展示技术及其在感染性疾病中的应用
感染性疾病是病原体与宿主相瓦作用的结果.了解病原体与宿主相互作用的分子基础,对于感染性疾病的预防和控制尤为重要.噬菌体展示技术不仅广泛应用于抗原表位作图和抗体工程技术,而且还可用于研究蛋白质与配体的相互作用,以揭示感染过程中蛋白与配体的相互作用机制.本文仅就噬菌体展示技术及其在感染性疾病中的应用作一综述.
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噬菌体展示技术发展
噬菌体表面展示技术是一种将外源蛋白或抗体可变区与噬菌体表面特定蛋白质融合并展示于其表面,构建蛋白质或抗体库,并从中筛选特异蛋白质或抗体的基因工程技术.随着该项技术的不断完善和发展,噬菌体展示技术已被广泛应用于生命科学研究的不同领域,并显示了良好的应用前景.
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噬菌体展示技术及其应用的研究进展
噬菌体展示技术因其高效、实用、便捷的优势现已广泛应用于抗原表位分析、抗体制备、药物筛选、疫苗研制以及免疫学疾病诊断、治疗等多方面的科学研究领域.现将近年来PDT的发展现状及其在生物科学领域中的应用进展综述如下.
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噬菌体展示肽在促进药物透过皮肤和血脑屏障中的应用
本文阐述了噬菌体展示肤在促进药物透过皮肤、血脑等生理屏障方面的研究应用及其展望.
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布鲁杆菌侵染巨噬细胞过程中与外膜蛋白25作用的受体筛选
目的 筛选布鲁杆菌侵染巨噬细胞过程中与布鲁杆菌外膜蛋白(OMP)25作用的受体.方法 利用已经构建的pET32a-omp25表达载体,在异丙基硫代半乳糖苷OPTG)诱导下表达重组OMP25.蛋白,Ni-NTA柱纯化OMP25蛋白;采用噬菌体展示技术从M13噬菌体环形多肽展示库中进行环形7肽(c7c)的筛选;生物信息学软件分析筛选出潜在多肽,用酶联免疫吸附试验(ELISA)验证OMP25与多肽分子的结合活性;合成结合力高的7肽分子,用菌落形成单位计数和ELISA法检测其在布鲁杆菌感染小鼠巨噬细胞过程中的功能.结果 噬菌体展示技术共筛选出42个7肽分子;生物信息学软件分析筛选出4个潜在多肽,ELISA证实4个7肽分子(ST-7、MT-7、TT-7和SN-7)能够与布鲁杆菌OMP25蛋白具有高亲和力;菌落形成单位计数结果显示:多肽分子ST-7、MT-7、TF-7和SN-7在布鲁杆菌黏附或抑制胞内寄生中均有一定作用.ST-7、MT-7、TF-7和SN-7对牛种布鲁杆菌2308菌株的抑制率范围分别为14.4％～51.8％、49.6％～69.5％、43.2％～74.4％、57.5％ ～82.2％.ELISA结果显示,与对照组比较,ST-7和MT-7多肽实验组肿瘤坏死因子(TNF-α)的量在各个时间点的差异无统计学意义(P均＞ 0.05);而TF-7和SN-7多肽实验组TNF-α的量在8h前差异无统计学意义(P均＞0.05),但在12、24h时促进TNF-α的分泌,差异具有统计学意义(P均＜0.05).结论 筛选获得4个有效的OMP25作用受体,其中TF-7、SN-7对布鲁杆菌2308侵染小鼠巨噬细胞既抑制入侵又抑制胞内生存,ST-7、MT-7对其只起抑制入侵的作用.
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噬菌体抗体库技术
噬菌体抗体库技术是20世纪90年代继噬菌体展示技术发展而来.这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段.噬菌体抗体库技术是迄今发展成熟、应用广泛的抗体库技术.本文对与基因工程抗体相关的噬菌体展示技术以及噬菌体抗体库技术作一综述.
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全人源单克隆抗体现状及发展趋势(续)
4 技术平台全人源单抗是抗体工程技术发展的重要趋势.目前全人源单抗的研发技术主要有:B细胞永生化技术、噬菌体抗体库技术、转基因小鼠技术以及人源杂交瘤技术等.其中以噬菌体展示技术和转基因小鼠技术实际应用广泛、成功.
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抗人α-烯醇化酶单克隆抗体的研制及其抗原识别表位初步鉴定
研制抗人α-烯醇化酶的单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步研究.利用原核表达系统对人α-烯醇化酶进行一系列重组表达.表达纯化后的人α-烯醇化酶作为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术以及克隆化培养筛选稳定分泌抗人α-烯醇化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用免疫荧光技术、免疫组化技术对此单克隆抗体加以验证,并应用噬菌体随机十二肽库展示技术结合生物信息学方法对抗体识别表位进行初步鉴定.结果显示,克隆表达了人α-烯醇化酶,筛选获得一株稳定分泌抗人α-烯醇化酶单克隆抗体细胞株,此单克隆抗体的亚型为IgG1,它可与腹腔巨噬细胞的胞膜及胞浆的烯醇化酶特异性结合.噬菌体随机十二肽库展示技术筛选出的氨基酸序列经生物信息学分析,初步确定此单克隆抗体的抗原表位为第259-262氨基酸与第267-269氮基酸,其恰好位于人α-烯醇化酶三维结构表面的凸环上.成功制备了一株抗人α-烯醇化酶单克隆抗体并对其抗原识别表位进行初步鉴定,为探究人α-烯醇化酶在人体病理生理活性中的作用提供了研究工具.
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人源化甲状腺球蛋白单链抗体FR区突变对其抗原结合力的影响
筛选具有活性人源化甲状腺球蛋白单链抗体,并探索FR区基因突变对人源化甲状腺球蛋白单链抗体抗原结合力的影响.利用噬菌体展示技术克隆Tg人源化抗体基因,获得FR区基因突变的克隆,鉴定并分析其对单链抗体抗原结合力的影响.通过基因序列分析,突变类型共有3种:FR-3区Met91→I1e91、FR-4区G1n117→His117及两种突变同时存在.抗原结合力实验显示,突变单链抗体与抗原的结合活性显著降低.软件分析显示:突变造成了抗体的CDR区及FR区空间结构的细微变化,抗体疏水性、亲水性及电势也明显发生改变.获得了具有活性的人源化甲状腺球蛋白单链抗体,FR区的突变对人源化甲状腺球蛋白单链抗体的抗原结合力影响显著.
