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聚合酶链反应检测结核性脑膜炎12例报道
近几年来,临床不典型结核性脑膜炎(以后简称结脑)患者有所增加,特别是脑脊液常规检查结果不典型,这给结脑患者的早期诊断带来一定困难,影响病人愈后.目前开展的聚合酶链式反应(PCR)技术检测脑脊液(CSF)具有快速、灵敏、特异性的特点.现报道如下.
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转基因大豆的PCR-免疫层析筛查方法研究初探
目的 建立转基因大豆的PCR-免疫层析(PCR-ICT)快速筛查新技术. 方法 利用转基因植物通常含有的CaMV35S启动子作为转基因成分的筛查标记,根据其序列设计特异性引物和探针,分别用生物素和地高辛标记,用胶体金免疫层析技术检测并鉴定PCR产物. 结果 用新建立的PCR-ICT方法可以检出含0.5%转基因大豆的标准品,对大豆样品的检测结果与琼脂糖凝胶电泳检测结果一致. 结论 PCR-ICT方法通过DNA杂交和金标显色来同时检测、鉴定PCR产物,可以简便、快速地筛查转基因产品.
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食品中沙门菌PCR检测方法的建立
为建立食品中快速检测沙门菌的PCR方法.选取沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA基因上的靶序列设计一对引物,选择适Mg++浓度和退火温度,建立适PCR反应体系,用2%琼脂糖,5μl反应产物(包括EB),100V,40min进行电泳,显像.用该引物对已经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌进行特异性检测,并对人工污染的食品进行检测条件的研究.Mg++浓度和退火温度对该反应体系的影响较小,稳定性较好;经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌验证了该检验方法具有很好的特异性;该检测方法可以在19 h内检出含有沙门菌102CFU/g的食品(火腿肠、鸡蛋、散装肉馅).与传统方法比较,该方法快速、敏感、特异,能在较短的时间内对大量样品同时进行检测,适用于食品中沙门菌的快速、敏感、特异检测.
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转基因水稻潮霉素标记基因PCR检测方法的建立及其在基因水平转移研究中的应用
为建立用于基因水平转移研究, 尤其是DNA经加工和消化后稳定性研究的针对转基因水稻潮霉素标记基因hpt(hygromycin phosphotransferase)的定性和实时定量PCR体系,设计针对hpt的上游通用引物多个片段定性PCR扩增体系,以植物叶绿体基因rbcl为内对照,PCR扩增产物经测序验证.将定性PCR中小片段(236 bp)连接到质粒载体pUC18-pMD T载体上,提取质粒经验证后做外标.应用TaqMan-MGB荧光探针和引物,建立定量的外标校正曲线法,并评价方法的精密度.建立的定性PCR体系能稳定扩增出236 bp～910 bp不同大小的5个hpt片段,并经测序验证.实时定量PCR的线性范围为105～10拷贝(R2=0.998),低能检出10拷贝,重复性好.本研究已成功建立了用于转基因水稻标记基因hpt基因水平转移研究的定性和定量PCR系统.
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食品中转基因成分的PCR快速检测研究
为建立食品中转基因成分的快速检测方法,针对转基因大豆、玉米、油菜的多个相对稳定的转基因元件,包括35S、NOS、EPSPS、Cry1A、NPTⅡ等基因,同时选定植物本身固有的基因:大豆Lectin、玉米IVR、油菜Napin基因作为内源参照指示基因,设计、筛选出9对引物分别组成多重PCR,结合高灵敏度的聚丙烯酰胺凝胶电泳组成快速检测体系对转基因食品进行检测,1～2 d能完成整个检测过程.经测试:该检测体系稳定可靠、灵敏准确、特异性好,且操作简便、成本低廉,是一种进行转基因食品检测的良好技术模式.
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转基因大豆低密度基因芯片的检测方法研究
目的 建立Roundup Ready转基因大豆(简称RRS)的基因芯片检测方法,探讨其在转基因大豆检测中的应用.方法 根据大豆中所转入的外源基因,选择camv35s启动子、nos终止子和cp4epsps基因,以大豆内源基因lectin基因为内参照基因设计了引物和探针,并制备了核苷酸芯片;通过多重PCR对样品核酸进行扩增和荧光标记后,将PCR产物与芯片杂交,检测大豆样品中所含的外源基因,并评价方法的灵敏度.结果 检测转基因含量不同的RRS标准参考物,结果显示:camv35s启动子、nos终止子、外源基因cp4epsps检测灵敏度均可达0.45%.结论 本研究所建立的基因芯片检测方法有良好的灵敏度及可重复性,有助于实现转基因大豆的高通量、高灵敏的检测.
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3种方法检测婴幼儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌
目的 时市售婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌检测方法进行研究.方法 分别用常规培养鉴定方法、常规PCR方法和实时荧光PCR方法对32份奶粉样品进行阪崎肠杆菌分离鉴定.结果 32份样品中检出2株阳性株,阳性率为6.25%,3种鉴定方法结果相符.结论 联合使用多种鉴定方法可提高阪崎肠杆茵检测的可靠性.
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应用双重Real-time PCR同步定量检测食品中的副溶血性弧菌及金黄色葡萄球菌
为同时测定食品中的副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌,建立了基于TaqMan探针的双重Real-time PCR方法.针对副溶血性弧菌的gyrB基因序列和金黄色葡萄球菌coa基因序列分别设计引物和TaqMan探针,建立双重Real-time PCR 检测体系,制作校正曲线,同步定量检测副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌.建立的双重Real-time PCR方法对2种细菌菌液的检测敏感度均低于10 CFU/PCR反应体系,相关系数均为1.00,整个试验可在2 h内完成.建立的方法可用于食品中副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌的快速、同步、定量检测.
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食品中5种致病菌多重PCR快速检测技术的建立与应用
目的 建立一种能同时检测食品中沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌的多重PCR快速检测方法.方法 分别针对沙门氏菌侵袭基因invA、大肠杆菌O157∶H7肠溶血素A基因HLyA、金黄色葡萄球菌耐热性核酸酶基因nuc、单核细胞增生李斯特菌李氏溶血素O基因hlyA和蜡样芽孢杆菌肠毒素FM基因entFM序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测.同时优化反应体系,测定特异性和灵敏性.结果 初步建立的多重PCR方法可简便、快速、灵敏地实现对5种致病菌的同时检测,整个检测过程少于30h,且检测灵敏度均可达102 CFU/ml.结论 这种方法是对传统检测方法的有效改进,为食源性致病菌的快速高通量检测提供了理想手段,有良好的应用前景.
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SYBR(R) GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌
为应用SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法,根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物,进行SYB(R) Green Ⅰ实时PCR检测.以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测;沙门菌不同群菌株做重现性检测;将沙门菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.该方法有较好的特异性、重现性,沙门菌属5个群菌株均为阳性,而其它非同源菌株均为阴性.该方法灵敏度较高,检测低限为19 CFU/ml.该方法特异性强,重现性好,敏感性高,可以快速、准确检测食品中沙门菌.应用实时PCR技术,利用SYBR(R) Green Ⅰ染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到沙门菌中inv A基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过熔解曲线可知其熔点值约为80.4℃,而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号.SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法.
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空肠和结肠弯曲菌鞭毛蛋白基因fla A的检测
目的 运用一种快速、敏感、特异的检测空肠和结肠弯曲菌的方法.方法 以空肠和结肠弯曲菌所共有特异的鞭毛蛋白基因 fla A的一段高度保守序列为引物,用PCR法扩增fla A基因上的一段约1 700 bp的片断.用该引物对空肠和结肠弯曲菌的标准株、福建省的食品分离株进行PER扩增检测,并同时检测该PCR方法的敏感性.结果 扩增片断表现出极好的特异性,2株空肠和结肠弯曲菌标准菌株、8株分离自不同食品样品的空肠穹曲菌和结肠弯曲菌菌株均为阳性,且敏感性实验显示该PCR方法的反应体系低检出菌量为6 CFU.结论 该方法快速、敏感、特异,可用于突发性食物中毒和暴发感染的调查.
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单核细胞增生性李斯特菌毒力基因检测及DNA随机扩增多态性分型
为了解在昌平地区分离的单核细胞增生性李斯特菌(Lm)携带毒力基因的状况和DNA随机扩增多态性(RAPD)分型情况,采用聚合酶链反应(PCR)对28株Lm进行了溶血素基因(hly)、与侵袭性有关的iap和prfA基因的测定及RAPD分型.结果3个毒力基因PCR全部呈阳性反应,两株无害Lm为阴性反应.用RAPD分型,28株Lm分为12型,A、B两型共9株菌全部来自某肉联厂;C、D两型共10株来自某肉鸡公司;另外9株Lm有8个RAPD型,分男来自熟肉制品及零售市场.此次实验发现昌平地区在不同时间、不同地点分离的Lm其RAPD型别变化较大,有多种型别的细菌存在.根据RAPD分型看出肉联厂与肉鸡公司可能存在着内部污染问题.
关键词： 利斯特氏菌 单核细胞增生 聚合酶链反应 随机扩增多态DNA技术 毒力 -
PCR技术检测动物源性食品中沙门菌的应用研究
为快速准确检测动物源性食品中的沙门菌,将建立并优化的沙门菌PCR检测试剂盒应用于动物源性食品的检测,并于国标法进行了比较.对上海地区238份鸡蛋、685份原料牛奶、283份猪肉、314份牛肉和58份虾仁样品的沙门菌检测表明,PCR法的敏感性和特异性均为100%,与国标法的符合率亦为100%,且检测时间仅为2 d,较国标法大为缩短.该方法可用于动物源性食品中沙门菌的检测,并具有快速、特异、敏感等优点.
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蔬菜及水果中NLVs和HAV检测的研究
目的 建立蔬菜水果中诺沃克样病毒(NLVs)和甲肝病毒(HAV)的RT-PCR检测方法.方法 使用具有较强缓冲力的甘氨酸缓冲液将病毒从试样表面洗脱下来,用PEG6000将病毒沉降后进行RNA提取和RT-PCR检测.结果 蔬菜中NLVs和HAV检测的灵敏度可达1.0×103 RT-PCRU50/30 g试样和30 TCID50/30 g试样.而草莓样品的NLVs和HAV低检出限为1.7×103 RT-PCRU50/100 g试样和48 TCID50/100 g试样.结论 该方法灵敏、可靠.
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TaqMan探针法实时荧光定量PCR快速检测沙门菌的探讨
为建立一种快速、灵敏、特异的实时荧光定量PCR法用于沙门菌的检验,根据GenBank上登录的编号为AE016841的沙门菌序列,应用生物学软件在fimY基因的保守区设计引物和TaqMan探针,同时应用BLAST程序进行网上序列比对,并进行筛选、优化.用鼠伤寒标准菌和60份食品样本进行本检测方法的特异性、敏感性和重复性试验,并与常规法和科玛嘉平板分离法做比较.本方法对沙门菌的检测具高度的特异性,检测的灵敏度达102CFU/ml,从增菌至完成检测仅需24h左右,是一种快速检测沙门菌的敏感、特异的新方法.
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食品中单核增生性李斯特菌的PCR快速检测研究
为提高食品中单增李斯特菌的检测水平,针对单增李斯特菌中多个稳定的特异性基因hlyA、plcB、prfA、iap,设计并筛选出7对引物组成多重-巢式PCR联合检测体系,并结合高灵敏性的聚丙烯酰胺凝胶电泳,对单增李斯特菌进行快速检测,多重PCR的灵敏度达到1×102CFU/ml,巢式PCR的灵敏度达到1×10 CFU/ml.结果表明该检测体系具有快速可靠、灵敏准确及特异性好的特点,而且有效缩短了检验周期,从传统的7～14 d缩短到1～2 d.
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虫草胶囊菌粉的鉴定与分析
目的 探讨建立一种虫草胶囊菌粉真伪的检测方法.方法 以95%乙醇、乙酸乙酯和Tris-HC1对胶囊菌粉产品处理后再提取DNA,排除虫草胶囊菌粉中杂质对PCR扩增的干扰,采用PCR扩增该菌粉ITS1-5.8S-ITS2区的序列.结果 鉴定分析了3个不同厂家虫草胶囊产品的发酵菌粉,系统发育学分析表明样品1胶囊生产菌为中国被毛孢(Hirsutella sinesis),属于国家卫生部允许的可用于保健食品的真菌菌株;样品2和样品3分别为西藏虫草(Cordyceps gracilis)和蛹虫草(Cordyceps militaris),均与产品名称"冬虫夏草"(Cordyceps sinensis)不符,且不属于国家卫生部允许的保健食品菌株.结论 该方法简单易行,可以有效的鉴定市售虫草相关产品的真伪,为该类产品的真伪鉴定开拓了新的思路.
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中国部分水产品副溶血性弧菌毒力基因的分布特征
目的 了解中国部分水产品中副溶血性孤菌毒力基因的分布情况.方法 通过聚合酶链反应测定从中国部分水产品中分离的192株副溶血性弧菌是否携带毒力基因tdh、trh,及种特异性基因tlh、toxR.结果 192株实验菌株tdh全阴性,4株trh阳性,毒力基因携带率2.08%;而tlh、toxR的携带率均为100%.结论 中国副溶血性弧菌水产品分离株毒力基因携带率非常低.
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2种弧菌的实时荧光PCR快速检测
目的 为快速、特异、灵敏的检测致病性弧菌,建立致病性弧菌的实时荧光PCR方法.方法 针对霍乱弧菌的种特异性基因omp W、毒力基因tcp A、ctx A和副溶血性弧菌的种特异性基因tl、毒力基因tdh计引物和Taqman荧光探针,建立实时荧光PCR检测方法.结果 该方法能够特异性地检出副溶血性弧茼或霍乱弧菌,并进一步确定其是否携带tdh、tcp A或ctx A毒力基因,检测的灵敏度可达到10 CFU/ml或0.171 6 μg/ml(pg/μl)DNA模板浓度.结论 该方法特异性强、灵敏度高,适用于食品中致病性弧菌的快速检验.
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水产品中致病性弧菌污染状况研究
目的 了解水产品中致病性孤菌污染状况.方法 采用实时荧光PCR方法对样品中的致病性弧菌进行初筛.阳性样品用传统培养法确证.结果 检测了海产品、淡水水产品共12类1356份样品,未检出致病性的O1群霍乱弧菌,但有非O1群霍乱弧菌存在;海产品的虾类、蟹类、贝类、软体类带副溶血性弧菌率高.结论 珠海地区水产品中弧菌污染较为普遍,且存在着多重污染现象.
