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诱导多能干细胞/原代心肌细胞的融合细胞表现出双向重建
目的 体外构建诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSc)与原代心肌细胞的融合细胞,初步探讨融合细胞体外生物学特性.方法 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转染八聚体结合转录因子4(octamerbinding transcription factor-4,Oct-4)小鼠来源的iPSc与小鼠乳鼠心肌细胞通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG-4000)诱导融合,建立细胞融合模型.动态观察融合细胞生长形态变化情况,融合细胞碱性磷酸酶( alkali phosphatase,AKP)染色,免疫荧光鉴定融合细胞表达干细胞与心肌细胞特异性蛋白情况,以及染色体核型分析,确定融合细胞是否发生细胞核的融合及程度.结果 聚乙二醇( PEG-4000)能够介导iPSc与心肌细胞融合,融合后第4天开始出现成集落状生长的细胞团；第2、3、4、5天的iPSc和融合细胞AKP阳性率分别为(0.935±0.039)、(0.939±0.022)、(0.954 +0.017)、(0.944±0.027)和(0.761±0.044)、(0.740±0.023)、(0.681±0.034)、(0.748±0.045),同时间点的iPSc和融合细胞AKP阳性率比较有明显差异(P＜0.05)；融合细胞初期主要表现为iPSc的特点,Oct-4表达阳性,cTnT表达阴性,融合7d后,逐渐表现出两种细胞的特点,Oct-4与cTnT均表达阳性；超过80％的杂交细胞染色体数目在76 ～ 80条之间.结论 二倍体iPSc与二倍体心肌细胞的融合细胞,具有两亲本细胞的特性,表现出双向重建.
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MicroRNA对干细胞生物学行为的调控
目的:随着人类基因组计划的完成,对于RNA在生物体内功能的研究日益受到重视.自1993年的第一个microR-NA(miRNA),lin-4,发现以来,人们逐渐意识到生物体内有这样一些非编码的RNA,它们对基因的表达调控起着非常重要的作用.研究表明,在生物界存在着一个庞大的miRNA家族,参与调控生物体生长发育等许多复杂的生命过程,并且与干细胞的自我更新和多向分化存在着紧密关联.miRNA通过与靶位点结合快速有效地降解靶基因miRNA或抑制蛋白质的翻译,下调CDK,cyc-lin,p21,p27等关键的细胞周期调控因子的表达,调控各种类型干细胞的更新与分化;miRNA还可以决定干细胞的命运,促进ips.本文主要论述了干细胞中miRNA作用通路及其对干细胞生物学行为的调控.
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诱导多能干细胞在血液学方面的研究进展
诱导多能干细胞(iPSCs)是通过基因转染技术将某些转录因子导人到动物或人的体细胞中,使体细胞直接重构成为胚胎样干细胞样的多潜能细胞,因其广泛的科研价值及应用前景而迅速成为科学领域的研究热点.近年来,iPSCs在医学再生领域以及自身技术改进方面取得了令人瞩目的成绩,为其应用于临床提供了有力的理论保障.
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应用骨髓库HLA资料构建高匹配诱导多能干细胞库的可行性研究
目的 研究利用骨髓库HLA资料建立高匹配诱导多能干细胞(ipS)库的可行性.方法 通过对中华骨髓库湖南分库长沙实验室5236(人)份HLA分型数据统计分析,找出O型HLA-A、-B、-DRB1三座位纯合子数据,计算以纯合子志愿者为假定iPS供者、5236名随机志愿者为假定患者的匹配几率；同时计算随机志愿者HLA单体型频率,评估以O型HLA高频单体型纯合子志愿者为假设iPS供者的匹配几率.结果 在5236份骨髓供者资料中共发现O型HLA单体型纯合子14种,以此建库可以分别为49.81％ (2608/5236)、61.29％(3209/5236)、79.51％ (4163/5236)、75.76％ (3967/5236)及97.78％ (5120/5236)的假定患者提供5种匹配水平的iPS供者；共检出17种高频率(HF＞1％)的单体型,以这些单体型的O型纯合子建库可以分别为64.06％ (3354/5236)、75.55％ (3 956/5 236)、81.11％ (4 247/5 236)、78.76％ (4124/5236)及98.28％ (5146/5236)的假定患者提供5种匹配水平的iPS供者.结论 利用中华骨髓库现有的HLA资料可以建立数量少、效率高的iPS细胞库.
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多能干细胞诱导分化成血小板的研究进展
人类多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞,二者均可以在体外无限增殖及实现向巨核系分化,从而产生血小板,现已成为研究血小板生成的有力工具,尤其是特定疾病来源的诱导多能干细胞更是研究血小板疾病发病机制及药物筛选的重要工具.随着血小板体外培养技术的不断进步,相信在不久的将来各种基因相关的血小板疾病发病机制可以得到明确.此外,诱导多能干细胞来源的血小板也可作为临床用血的重要来源.
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胚胎干细胞和诱导多能性干细胞在输血医学上的应用潜能
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)是由早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外抑制培养而筛选出的细胞,它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性.无论在体外、还是体内环境,ESC都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型.人类ESC的研究工作在全世界范围内都具有很大争议,支持者从科学的角度,认为它在器官再生、修复和疾病治疗方面"极具应用价值";而反对者则着眼于伦理,认为ESC研究势必破坏胚胎,与"尊重生命"的理念不符.值得庆幸的是,2007年日本和美国科学家分别用转录因子Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc或Oct4/Sox2/Nanog/ Lin28将人成纤维细胞重新编程,并得到了具有与ESC功能类似的多能性干细胞,命名为"诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)"[1,2],这就不仅解决了ESC在伦理方面的争议,而且还可以弥补ESC在组织相容性问题上的缺陷.近年关于iPSC的研究迅猛发展,研究成果层出不穷[3～7].除了成纤维细胞之外,人的很多其他成熟体细胞都可被重新编程诱导成iPSC,因此来源也不受限制.
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诱导多能干细胞技术在遗传性心律失常研究中的应用
诱导多能干细胞技术的出现,第一次将终末分化的人体细胞重新编程为具有多种分化潜能的多能干细胞,使干细胞研究得以避开伦理学问题,为将干细胞应用于疾病的研究提供了新的方向.随着Moretti和Itzhaki等分别成功地将诱导多能干细胞技术应用于建立长QT综合征1型和2型的体外心肌细胞模型,这为遗传性心律失常的研究提供了崭新的思路和工具.现将从诱导多能干细胞技术及其在遗传性心律失常研究的应用等方面进行介绍.
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壳聚糖/胡须/磷酸钙骨水泥复合生物材料的力学性能及对诱导多能干细胞成骨潜能的影响
目的 观察新型强化型磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)生物支架材料的力学性能以及对诱导多能干细胞(induced potential stem cells,iPS)生物活性及成骨潜能的影响.方法 根据制备的支架材料不同,将实验分为4组,A组为单纯CPC支架组,B组为CPC∶10％wt壳聚糖为2:1比例混合支架组,C组为CPC∶10％wt壳聚糖∶胡须为2∶1∶1比例混合支架组,D组为CPC∶10％wt壳聚糖∶胡须为2∶1∶2比例混合支架组.检测各组支架材料力学性能(抗弯强度、断裂功、硬度及弹性模量).与第5代iPS-MSCs复合培养1、3、7、14d采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测各组吸光度(A)值;1、7、14d行ALP活性检测、Live/Dead荧光染色及定量检测、RT-PCR检测成骨基因ALP、Runx2、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白(osteocalcin,OC)及BMP-2表达;1、7、14、21d行茜素红染色观察.取3月龄雄性SD大鼠24只,建立8 mm颅骨骨缺损模型,随机分为4组(n=6),分别植入对应的4组支架材料,术后8周取材行HE染色观察骨缺损修复情况,并检测新生骨体积百分比和新生血管密度.结果 B、C、D组抗弯强度、断裂功、弹性模量及硬度均显著高于A组,C、D组高于B组,D组高于C组,差异均有统计学意义(P＜0.05).CCK-8法检测示随培养时间增加,细胞活性逐渐增加,3、7、14d时B、C、D组A值均显著高于A组,C、D组高于B组(P＜0.05),C、D组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).Live/Dead荧光染色示,7、14d时B、C、D组活细胞比例均显著高于A组(P＜0.05),7d时C、D组显著高于B组(P＜0.05);RT-PCR检测示,7、14d时B、C、D组各基因相对表达量均显著高于A组,C、D组显著高于B组(P＜0.05),C、D组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);茜素红染色示随培养时间延长,各组支架材料表面的红色钙盐沉积均逐渐加深变厚,14、21d时B、C、D组A值均显著高于A组,C、D组高于B组(P＜0.05),C、D组间差异无统计学意义(P＞0.05).动物体内修复实验显示,各组新生骨主要填充于支架材料间隙中,成骨细胞和新生血管被基质中的新生骨组织包围,成骨细胞排列在新生骨边界上,B、C、D组新生骨显著多于A组,C、D组显著多于B组.B、C、D组新生骨体积百分比和新生血管密度均显著高于A组,C、D组高于B组,差异有统计学意义(P＜0.05);C、D组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 复合壳聚糖、胡须和CPC制备的新型强化型复合生物支架材料的机械性能明显优于单纯CPC支架材料,可满足皮质骨及松质骨的机械性能要求.iPS-MSCs在新型强化型复合生物支架材料上黏附、增殖,骨组织修复效果良好,可满足骨植入材料的生物活性及成骨活性要求.
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尿源性干细胞在骨骼肌肉系统再生领域应用的研究进展
目的 总结尿源性干细胞(urine derived stem cells,USCs)在骨骼肌肉系统再生领域的应用.方法 查阅国内外近年来有关USCs在骨骼肌肉系统再生领域的相关文献,并进行综合分析.结果 USCs取材无创,来源广泛,表达MSCs表面标记,具备稳定的增殖能力、多向分化潜能,被广泛应用于骨、皮肤、神经等骨骼肌肉系统的再生领域并展现了一定修复能力.结论 无创来源USCs在骨骼肌肉系统再生领域具备良好的应用前景,但其修复的生物学机制尚需进一步研究.
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诱导多能干细胞体外分化为雪旺细胞的研究进展
目的 对近年诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)体外诱导分化为雪旺细胞的相关研究进展进行综述.方法 查阅目前iPS体外诱导分化为雪旺细胞的相关文献,对iPS体外分化为雪旺细胞的诱导方案以及对分化形成的雪旺细胞进行鉴定和功能性检测方法进行总结.结果 研究表明iPS可诱导分化为雪旺细胞,但目前需要先将iPS诱导分化为神经嵴细胞或神经嵴干细胞,再将其进一步分化为雪旺细胞.S100-β和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)为公认的雪旺细胞标记物.当神经嵴细胞或神经嵴干细胞分化前标记为p75+、HNK1+或nestin+,诱导后标记为S100-β+、GFAP+,表明诱导产生的是雪旺细胞.结论 将iPS诱导分化为雪旺细胞的研究虽然已有进展,但目前成功的诱导方案甚少,仍需对其进行深入研究.
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诱导多能干细胞研究现状及展望
Takahashi和Yamanaka通过瞬时高表达外源性的转录因子,首次得到了诱导多能干细胞,这种具有多潜能细胞特性细胞的诞生,预示着一种新的干细胞研究方法的到来.本文就诱导多能干细胞的发展历程及新进展作一综述.
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体外电刺激对维生素C诱导的多能干细胞向心肌细胞分化的影响
目的 探讨电刺激在体外对诱导性多能干细胞(iPSCs)向心肌细胞分化的作用.方法 复苏小鼠来源的iPSCs,悬滴培养法形成拟胚体,维生素C诱导其分化,诱导过程按是否给予电刺激分为电刺激组与非电刺激组.观察各组细胞生长情况,记录各组拟胚体出现跳动的时间和跳动拟胚体的数量,计算心肌细胞分化率.共聚焦显微镜成像结合免疫荧光细胞化学检测心肌特异性肌钙蛋白T(c-TnT)的表达.RT-PCR检测干细胞多能性标志因子Oct-4、心肌早期特异性转录因子GATA-4和心肌特异性肌球蛋白0重链(α-MHC)的基因表达.结果 电刺激组拟胚体较非电刺激组分化更快,更早出现搏动,心肌细胞分化率更高[(68.89 +5.09)％ vs(52.22±3.85)％,P＜0.05].两组搏动区域细胞均表达c-TnT,电刺激组细胞c-TnT表达更明显.在诱导过程中,Oct-4表达水平随诱导时间延长逐渐减少,电刺激组较非电刺激组递减更快(P＜0.05).两组均检测到心肌特异性标记分子GATA-4和α-MHC的表达.在诱导分化相同时间点,电刺激组GATA-4和α-MHC表达水平高于非电刺激组(P＜0.05).结论 模拟心脏电学微环境的电刺激有助于维生素C诱导的iPSCs在体外向具有心肌细胞表型特征的细胞分化.
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纳米纤维仿生支架可诱导iPSC向心肌细胞分化
目的 利用诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)与纳米纤维仿生支架构建人工心肌,探讨纳米纤维支架用于诱导多能干细胞心肌特异性分化的可行性及潜在作用,为构建组织工程心肌提供参考.方法 采用静电纺丝技术制作聚己内酯/明胶复合纳米纤维仿生支架,接种鼠源Oct4-GFP+ iPSCs培养分化15 d.鼠源Oct4-GFP+ iPSCs同样接种于组织培养皿,培养分化15 d作为对照组.免疫荧光染色检测心肌细胞特异性标志物,流式细胞计数统计心肌细胞分化效率.结果 Oct4-GFP+ iPSCs能够在聚己内酯/明胶复合纳米纤维仿生支架上正常增殖、分化;培养15 d后,Oct4-GFP+ iPSCs在支架上分化出心肌细胞特异性标志物cTnT/MLC2a双染阳性的心肌细胞;而且支架组心肌细胞分化效率显著高于对照组(P＜0.05).结论 聚己内酯/明胶纳米纤维仿生支架支持iPSCs增殖,且能够促进其向心肌细胞分化,适用于组织工程心肌构建.
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生长分化因子-11促进小鼠诱导性多能干细胞向心肌细胞定向分化的研究
目的 明确生长分化因子(GDF)-11对小鼠诱导多能干细胞(miPSCs)向心肌细胞定向分化的促进作用,为心肌再生的细胞生物学治疗提供种子细胞和实验依据.方法 常规培养小鼠miPSCs,分为对照组和GDF-11组.GDF-11组在普通分化培养基中加用10 ng/ml的GDF-11.悬滴法诱导培养形成拟胚体(EBs),每日观察搏动拟胚体数目.采用实时荧光定量PCR检测多能干细胞标志物Oct-4、心脏中胚层标志物Flk-1、心脏祖细胞标志物Nkx2.5、和心肌特异性标志物cTnT的表达变化.用免疫荧光染色观察心肌结构蛋白cTnⅠ的表达水平.结果 GDF-11组的Oct-4表达水平在诱导分化的第3、7天分别为同期对照组的(0.55±0.31)倍(P＜0.01)和(0.41±0.57)倍(P＜0.05);诱导分化的第10天,GDF-11组的Flk-1和Nkx2.5表达相分别为对照组的(2.09±0.8)倍(P＜0.05)和(2.47±0.22)倍(P＜0.01);cTnT的表达在分化后第10天和第14天分别为对照组的(1.81±0.19)倍(P＜0.01)和(1.61±0.20)倍(P＜0.01);两组均出现了心肌样搏动细胞团,GDF-11组搏动EBs百分比要显著高于对照组(P＜0.01).免疫荧光染色显示,GDF-11组的cTnⅠ阳性率要显著高于对照组(P＜0.01).结论 GDF-1能够显著促进miPSCs的心肌定向分化.
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诱导多能干细胞与转分化在心肌再生中的研究进展
以往认为,心肌受损后,心肌细胞不能再生,常由瘢痕组织修复,从而使心脏失去结构与功能上的完整性.随着心肌再生机制研究的不断深入和转化医学的发展,已证实在一定条件下,心肌能够再生并产生正常的心肌细胞,并已逐渐成为临床上心肌损伤修复的研究热点.本文对诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)与转分化在心肌再生领域的研究进展做一综述,旨在为心肌再生的临床治疗提供新的思路.
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小鼠胚胎成纤维细胞滋养层对小鼠诱导多能干细胞的作用研究
目的:探讨小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)滋养层对小鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)适宜的培养条件及其作用机制.方法:取E12.5~14.5d ICR孕鼠,培养小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs),制备滋养层,收集第2~3代(P2~P3)和第6代(P6)培养2~4d MEFs滋养层细胞培养基(MEF-CM),ELISA检测P2~P3和P6 MEF-CM中Activin A、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的浓度水平.iPSCs与滋养层细胞共同培养,并进行细胞鉴定.结果:ELISA检测结果显示P2~P3 MEF-CM中Activin A、LIF的浓度显著高于P6 MEF-CM,差异有显著性意义(P<0.05).iPSCs呈克隆状生长,细胞鉴定结果显示:拟胚体形成;碱性磷酸酶染色呈阳性;0CT4表达阳性.结论:E12.5~14.5d来源的P2~P3 MEFs滋养层能有效的抑制iPSCs的分裂,支持iPSCs的生长并维持其全能性.
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多发性内分泌腺瘤病1型患者血液细胞来源特异性诱导多能干细胞的建立
目的:建立多发性内分泌腺瘤病1型(multiple endocrine neoplasia 1,MEN1)患者血液细胞来源的特异性诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)模型.方法:将表达Oct4、Sox2、Lin28、L-Myc和Klf4转录因子的oriP/EBNA1附着体电转染MEN1患者血液细胞使其重编程获得iPSCs,并通过碱性磷酸酶染色、核型鉴定、基因测序、RT-PCR反应、畸胎瘤形成实验及类胚体形成实验检测其特性.结果:获得的iPSCs碱性磷酸酶染色呈阳性,核型正常,测序结果显示在其第9号外显子存在c.1288 G>T位点突变,表达干细胞多能性基因Sox2、Oct4、Nanog和Klf4和Lin28,体内畸胎瘤形成实验可分化为内、中、外三胚层细胞,体外可形成类胚体.结论:成功获得携带第9号外显子c.1288 G>T位点突变的MEN1患者血液细胞来源的特异性iPSCs,为后续机制研究奠定基础.
关键词： 多发性内分泌腺瘤病1型 血液细胞 转录因子 重编程 诱导多能干细胞 -
小鼠iPS细胞体外自发性分化及神经定向分化中基因表达谱的研究
目的:研究小鼠诱导多能干细胞(iPS细胞)在体外自发性分化和神经定向分化过程中的基因表达谱的特性.方法:在体外将iPS细胞分别进行形成类胚胎小体后自发性分化及成骨蛋白抑制剂Noggin诱导神经定向分化后,通过实时荧光定量PCR(qPCR)测定在分化过程中iPS细胞分化相关基因表达的变化.结果:iPS细胞形成类胚胎小体后胚胎外胚层标志基因(GFAP,Map2和TuJ1)及内胚层标记基因(Foxa2,GATA4和Sox17)的表达随分化而迅速增加,但中胚层标记基因(Bmp4,BRA,FGF5)表达水平变化不明显.在神经定向分化过程中,iPS细胞的神经标志物基因(Map2,NeuN,TuJ1和Sox1)及线粒体相关基因(12s,ND3,ND5,ND6、Cytb和Cox1)的表达都逐渐增加,且两者具有相同的增长趋势.结论:在自发性分化过程中小鼠iPS细胞具有自发向外胚层和内胚层分化的趋势;在神经定向分化过程中,iPS细胞的线粒体相关基因表达随着分化表达逐渐增加,并与神经细胞标记基因具有正相关性,表明线粒体的功能在iPS细胞神经定向分化中发挥重要作用.
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诱导多能干细胞的研究
干细胞(stem cell)不仅可用于细胞分化、基因表达调控、胚眙发育等生物发育机制的研究,而且可应用于药物研制、细胞替代治疗和基因治疗等研究.一直以来都是生命科学领域的研究热点.根据细胞来源可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞.
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诱导多能干细胞在眼科疾病的研究进展
可诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)是由体细胞或成体细胞重编程转化而来,这项技术引起了学术界空前的关注,越来越多的相关研究随之开展.它是通过人工方法将适当的外源性转录因子导入体细胞或成体干细胞,使之转化为具有无限增殖潜能和定向分化能力、类似于胚胎干细胞的一类干细胞.在不断探索发展多能干细胞培养转化技术的过程中,已经取得不少突破性的进展,这为将来细胞移植成为临床治疗方法奠定了基础.同时各种研究成功诱导出类似人体细胞的干细胞,并在动物实验中得到乐观的结果.我们主要探讨iPSC在眼科疾病方面的研究进展.
