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酶活性评价文献资料
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HPLC法测定大鼠UGT1A6的酶活性及体外动力学分析
目的:建立灵敏、稳定的高效液相色谱法,以对硝基酚为探针底物,评价体外大鼠肝微粒体中UGT1 A6酶活性.方法:色谱柱为Agilent Zorbax SB -C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为20 mmol·L-1磷酸二氢钾缓冲液-甲醇(50∶50,V/V),流速0.8 mL·min-1,柱温30℃,检测波长280 nm.对硝基酚与大鼠肝微粒体在37℃共同孵育一段时间后,加入冰乙腈终止反应,于4℃下12000 r·min-1离心15 min后,吸取上清进行HPLC分析,以双倒数作图法计算酶动力学参数.结果:对硝基酚保留时间为8.95 min,线性范围为0.5～100 μmol·L-1,回归方程为Y=5973.12X +571.58(r=0.9999),低检测限(LOD)为0.1 μmol·L-1(S/N≥3),低定量限(LLOQ)为0.5μmol·L-1,回收率为104.5％～105.5％,日内、日间RSD均小于10％,温孵体系中其他内源性物质不干扰测定；计算酶动力学参数Km为24.63 μmol·L-1,Vmax为18.87 nmol·min-1·mg ·protein-1.结论:该方法灵敏度高、稳定性好,适合体外对硝基酚的测定,可用于大鼠体外UGTlA6酶活性的评价及酶动力学研究.
