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Munc18-1文献资料
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GST-hMunc18-1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达
目的:构建hMunc18-1的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达.方法:从人HEK293细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hMunc18-1基因全长,通过EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点将其定向插入pGEX-6p-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-6p-1-hMunc18-1.异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在E.coli BL21大肠杆菌中诱导GST-hMunc18-1融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western Blot鉴定结果.结果:hMunc18-1编码序列克隆至pGEX-6p-1载体中,双酶切鉴定片段大小为1785 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为67 000 Da,成功纯化出GST及GST-hMunc18-1蛋白,Western Blot检测到蛋白表达.结论:成功地构建了hM unc18-1基因原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化Munc 18-1及研究其结构与功能奠定了基础.
