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hBMP-7基因在脂肪源性干细胞中的表达及对其向成骨细胞分化的影响
目的 构建hBMP-7基因真核表达载体,观察其在兔脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的表达,并观察其对ADSCs向成骨细胞分化的影响.方法 3月龄清洁级健康日本大耳白兔,雌雄不限,体重3～4 kg.取兔皮下脂肪约5 mL,采用胶原酶消化离心贴壁培养法培养ADSCs,取第3代细胞进行实验;CD44、CD49d、CD106免疫荧光染色鉴定ADSCs.构建真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-7,经鉴定后利用LipofectamineTM 2000介导转染ADSCs,免疫组织化学染色检测hBMP-7在ADSCs中的表达;ALP定量测定、Ⅰ型胶原免疫荧光检测hBMP-7基因转染对ADSCs向成骨细胞分化的影响.结果 倒置相差显微镜观察示ADSCs呈梭形、多角形分布;表面抗原标志CD44、CD49d呈阳性表达,CD106呈阴性表达.成功构建pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体,并利用脂质体介导的方法成功导入ADSCs中,免疫组织化学染色提示hBMP-7能在ADSCs中表达.ALP定量测定示,转染后7、10、14 d pcDNA3.1-hBMP-7转染组(实验组)ALP活性明显高于pcDNA3.1空载体转染组(对照组),差异有统计意义(P＜0.05);转染后7、14 d,实验组Ⅰ型胶原表达量均高于对照组(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-7可在兔ADSCs中表达,且转染后的ADSCs ALP定量测定、成骨标志物Ⅰ型胶原的表达均高于pcDNA3.1空载体转染细胞,为开展以干细胞为载体的局部基因治疗奠定了基础.
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hVEGF_(165)及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体的体外生物学活性研究
目的 通过体外实验探讨hVEGF_(165)和hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus,rAAV)体外生物学活性,为体内应用其进行骨坏死的基因治疗奠定理论基础. 方法 分别采用rAAV-hVEGF_(165)-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-hBMP-7(实验组)、绿色荧光蛋白(green fluores-cent protein,GFP)标记的rAAv-IRES-GFP(对照组)转染体外培养的第3代兔BMSCs,于转染后1、2、3、7及14 d应用ELISA法及转染后14 d应用Western blot法鉴定两组hVEGF_(165)和hBMP-7表达;转染后14 d行细胞免疫荧光染色观察hVEGF_(165)和hBMP-7表达一致性.应用第3代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)管状血管形成实验检测hVEGF_(165)蛋白活性.取第3代BMSCs行诱导成骨实验,Gomori钙钴法ALP染色及茜素红法钙盐染色检测hBMP-7蛋白活性. 结果 ELISA检测示随转染时间延长,两组hVEGF_(165)和hBMP-7表达逐渐升高;实验组各时间点hVEGF_(165)和hBMP-7表达量均明显高于对照组(P＜0.05).Western blot检测示实验组可见hVEGF_(165)和hBMP-7表达,对照组未见阳性表达.细胞免疫荧光染色观察示实验组hVEGF_(165)和hBMP-7染色呈阳性,表达部位和强度具有较好一致性;对照组未见阳性表达.HUVEC管状血管形成实验示实验组HUVEC拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构;与对照组相比,管状血管数比较差异有统计学意义(P＜0.05).ALP染色见实验组细胞出现深染颗粒,对照组细胞内浅着色;与对照组相比,矿化结节数比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 双基因共表达rAAV-hVEGF_(165)-IRES-hBMP-7体外具有良好的生物学活性.
关键词： 重组腺相关病毒载体 hVEGF_(165) hBMP-7 共表达 生物学活性 -
国人BMP-7成熟肽基因克隆及序列测定
目的：证实人牙乳头细胞中BMP-7的表达，获得hBMP-7成熟肽基因。方法：提取人牙乳头细胞总RNA，反转录合成cDNA，以特异性引物扩增hBMP-7成熟肽基因并克隆入T载体，筛选阳性克隆进行序列测定。结果：PCR扩增得到一特异性的约430bp的片段，克隆后筛选出阳性克隆，序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致。结论：人牙乳头细胞中有BMP-7基因的表达，并克隆得到hBMP-7成熟肽基因，为hBMP-7在牙齿发育中的作用及其功能研究奠定了基础。
