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自组装多肽纳米凝胶支架三维培养前软骨干细胞的实验研究
目的 构建新型自组装多肽纳米凝胶支架RGDmx,探讨支架的细胞相容性及其对前软骨干细胞(precartilaginous stem cells,PSCs)增殖和向软骨细胞方向分化的影响. 方法 取新生SD大鼠四肢长骨干骺端组织分离培养PSCs,采用免疫磁珠分选系统分选纯化原代细胞,并进行鉴定.取KLD-12、KLD-12-PRG多肽冻干粉,以体积比1:1复合构建RGDmx.将纯化后的第3代PSCs接种至KLD-12(对照组)和RGDmx(实验组)培养,1、3、7、14d用细胞计数(cell counting kit,CCK)-8法检测支架细胞增殖-毒性; 制备不同混合比(0、20％、40％、60％、80％、100％)RGDmx,观察其对PSCs增殖的影响;采用无血清软骨形成培养液(complete chondrogenie medium,CCM)诱导两组支架内PSCs向软骨细胞方向分化,培养14d时行甲苯胺蓝染色法鉴定,并用RT-PCR法检测两组软骨分化特异性基因Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达情况. 结果 成功分离纯化获得成纤维细胞生长因子受体3表达阳性细胞,免疫组织化学染色及免疫荧光染色鉴定为PSCs.CCK-8检测结果显示,复合培养后实验组细胞吸光度(A)值随培养时间延长逐步提高,7d达峰值; 其中7、14d时细胞A值高于对照组(P＜0.05); 复合培养7d时,混合比为40％组细胞A值较其他混合比组高,差异有统计学意义(P＜ 0.05).CCM诱导培养14 d时,两组支架内细胞甲苯胺蓝染色均呈阳性;RT-PCR检测示实验组细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 自组装多肽纳米凝胶支架RGDmx具有良好的细胞相容性,可有效促进PSCs增殖及向软骨细胞方向分化,是组织工程较理想的细胞载体系统.
关键词： 组织工程支架 自组装多肽纳米凝胶支架 前软骨干细胞 关节软骨缺损修复
