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低氧诱导因子1α及2α在人BMSCs成软骨分化中的表达规律
目的 通过诱导人BMSCs(human BMSCs,hBMSCs)成软骨分化,观察低氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)、HIF-2α在分化过程中的表达趋势,为阐明HIF参与调控成软骨分化机制提供依据.方法 对已消化的悬浮hBMSCs进行离心沉淀,形成细胞微球.将细胞微球分为2组,对照组加入含2％FBS的H-DMEM培养基,成软骨诱导组加入软骨诱导液,于低氧(2％O2)条件下培养.培养3周后行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,培养1周行Western blot检测HIF-1α、HIF-2α蛋白表达,培养1、2、3周行实时定量PCR检测成软骨分化关键转录因子及相关标志基因表达.结果 甲苯胺蓝染色示,对照组染色细胞核整体分布稀疏,而成软骨诱导组分布致密;成软骨诱导组细胞外基质染色明显较对照组深.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示阳性信号主要位于细胞质内;与成软骨诱导组相比,对照组细胞核分布较稀疏且着色浅.Western blot检测示,培养1周成软骨诱导组HIF-1α和HIF-2α蛋白相对表达量均显著低于对照组(t=8.345,P=0.001;t=7.683,P=0.002).实时定量PCR检测示,与对照组比较,成软骨诱导组HIF-1α mRNA相对表达量在培养1周时降低、2周时显著升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);3周时两组比较差异无统计学意义(p＞0.05).成软骨诱导组培养各时间点HIF-2α mRNA相对表达量均显著低于对照组,Sox-9 mRNA相对表达量均显著高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.01).培养过程中,Ⅱ型胶原及X型胶原表达呈逐渐增加趋势,第2、3周时两者的mRNA相对表达量显著高于对照组(P＜0.05).而成软骨诱导组多聚蛋白聚糖mRNA相对表达量在各时间点均高于对照组(P＜0.05).结论 HIF-1α参与诱导hBMSCs成软骨分化过程,但HIF-2α表达在该分化过程中受抑制.
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白血病抑制因子联合bFGF对人BMSCs增殖及分化的影响
目的 研究白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)联合bFGF对人BMSCs(human BMSCs,hBMSCs)增殖及分化的影响. 方法 取第4代hBMSCs,根据培养条件不同分为4组:A组为对照组,加入完全培养基(含10％FBS的a-MEM)常规培养;B组加入含10 ng/mL LIF的完全培养基;C组加入含10 ng/mL bFGF的完全培养基;D组加入含10 ng/mL LIF和10 ng/mL bFGF的完全培养基.采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)测定各组第4代hBMSCs生长曲线;倒置相差显微镜观察各组hBMSCs形态变化;流式细胞术检测各组第8代hBMSCs表面标志CD44、CD90、CD19、CD34表达情况. 结果 4组细胞生长曲线均近似S形,且细胞增殖速率表现为D组＞C组＞B组＞A组.各组细胞形态观察发现A组细胞较早出现衰老和分化现象;B组细胞早期形态维持较好,但增殖相对缓慢,后期出现部分衰老细胞;C组少量细胞呈神经样细胞分化,但增殖较快;D组细胞增殖迅速,且能长期维持hBMSCs形态特征.流式细胞术检测示,A、C组骨髓基质标志CD44、CD90表达较B、D组低;各组造血细胞标志CD19、CD34均呈阴性,组间差异不明显. 结论 LIF联合bFGF不仅可以维持hBMSCs的多向分化潜能,而且能够促进其快速增殖.
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腺病毒介导Wnt10b基因调控人BMSCs成骨成脂分化的体外实验研究
目的 体外实验研究腺病毒介导Wnt10b基因表达与抑制对人BMSCs (human BMSCs,hBMSCs)成骨成脂分化的调控. 方法 取健康成人髂骨骨髓分离培养hBMSCs,取第4代细胞并分为4组:A、B、C组分别加入Wnt10b基因表达腺病毒载体、Wnt10b基因沉默(Wnt 10b-shRNA)腺病毒载体和空病毒转染细胞,D组细胞不进行转染作为空白对照组.各组进行成骨、成脂和无诱导培养,通过ALP染色、茜素红染色和油红O染色检测Wnt10b对各组成骨成脂分化的影响,通过实时荧光定量PCR检测成骨和成脂相关基因表达,Western blot检测成骨和成脂相关蛋白表达,了解Wnt10b对hBMSCs成骨成脂转录和蛋白水平的影响. 结果 成骨诱导培养后ALP染色4组均呈阳性,A组呈强阳性,B组染色弱;茜素红染色A组出现大量片状融合褐色矿化结节,B组见少许点状褐色矿化结节,C、D组出现大量点状褐色矿化结节.成脂诱导培养后油红O染色B、C、D组呈强阳性表现,其中B组强;A组散在小团状着色区,数量较其他组明显减少.荧光定量PCR和Western blot结果示:A组成骨转录因子和蛋白表达高于B、C、D组,B组低于C、D组;而成脂转录因子和蛋白表达与成骨转录因子及蛋白表达情况相反. 结论 Wnt10b基因高表达促进hBMSCs向成骨分化,低表达则促进成脂分化.
