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pEGFP-N3真核载体文献资料
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pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的构建和鉴定
目的 构建pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为研究TFPI-2基因的功能做准备.方法 从胎盘组织中提取总RNA,逆转录合成cDNA,再以PCR法进行扩增.将扩增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表达载体上,经Xho Ⅰ和KpnⅠ双酶切后,行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定,同时测定其DNA序列.将pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体以脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法转染Topl0感受态细胞(转染组),同时设空白对照组(仅转染pEGFP-N3质粒)和未转染组(不予转染).采用Western blot法检测3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况.结果 总RNA经分光光度法验证,其纯度符合PCR法扩增的要求.构建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体经Xho Ⅰ和KpnⅠ双酶切后,行1％琼脂糖凝胶电泳,结果显示,分别在708 bp处和4 700 bp处有特异扩增条带,大小与理论值一致.DNA序列测定结果证实,pEFFP-N3-TFPI-2真核表达载体的序列完全正确.Western blot法结果显示,TFPI-2蛋白的表达量转染组为0.657 3±0.032 5,空白对照组为0.301 7±0.028 7,未转染组为0.314 3±0.026 6,转染组TFPI-2蛋白的表达量高于空白对照组和未转染组,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 本实验成功构建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为TFPI-2基因功能的研究奠定了基础.
