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Ara h2三聚体重组蛋白的制备及其低致敏原性鉴定
目的 制备花生主要过敏原Ara h 2三聚体重组蛋白并检测其过敏原性.方法 利用分子生物学的方法将3分子的Ara h 2依次串联起来,并将其整合到原核表达载体pET-32a(+),再转化到感受态Origami中;然后利用IPTG诱导其表达;通过Ni2+亲和层析纯化三聚体重组蛋白;Western-blotting和ELISA检测目的蛋白的过敏原性.结果 测序结果表明Trimer成功整合到pET-32a(+)上.三聚体重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,蛋白大小与理论值相符.Western-blotting和ELISA结果表明Trimer与重组的Ara h 2(r-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE的能力有所降低.结论 成功制备花生主要过敏原Ara h 2三聚体重组蛋白,初步的体外实验表明该重组蛋白具有低致敏原的潜能.
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经点突变的花生主要过敏原Ara h2低致敏原的制备与鉴定
目的 构建经点突变的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其过敏原性.方法 将Ara h 2基因进行点突变,并将其序列进行合成,再将合成后的基因连入原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入B121(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的 蛋白;Western-blotting和ELISA检测该重组蛋白的过敏原性.结果 测序结果表明合成后的序列成功转入原核表达载体pET-32a(+)上.重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的 蛋白大小与理论值相符.Western-blotting和ELISA结果均表明经点突变的Ara h 2蛋白(M-Ara h 2)与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE显著降低.结论 成功构建了经点突变的Ara h 2表达载体,初步的体外实验表明该基因表达的重组蛋白具有低致敏原的潜能.
