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PEI-SPIO标记对关节软骨细胞生物学特性的影响
目的 研究聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)包被的超顺磁性氧化铁粒子(superparamagnetic iron oxid,SPIO)对透明软骨细胞增殖和分泌Ⅱ型胶原蛋白功能的影响,探讨其标记软骨细胞的适宜标记浓度和适宜孵育时间.方法 取1～3月龄巴马小香猪后膝关节透明软骨体外培养的第2代细胞,以2、4、6、8、10、12、14 μg/mL浓度的PEI-SPIO标记液标记的软骨细胞为实验组,没有PEI-SPIO标记的软骨细胞作为对照组,分别在37℃培养箱中培育6、12、18、24、30 h,通过普鲁士蓝染色、透射电镜、细胞内铁含量、WST-1和半定量RT-PCR法检测,筛选出PEI-SPIO的佳标记浓度和佳孵育时间.结果 6、8、10、12、14μg/mL组标记后的普鲁士蓝染色显示90％以上的细胞被铁粒子标记；细胞内铁含量的测定结果显示标记时间超过24 h,各组细胞内铁含量基本不再增加；WST-1检测磁标记的细胞毒性结果显示,对照组与实验组无统计学差异(P＞0.05).8 μg/mL标记的软骨细胞,其Ⅱ型胶原蛋白RT-PCR条带的灰度值比值与未标记软骨细胞比较有明显降低[(13.04±0.60)％ vs(18.89±1.26)％,P＜O.05]；6μg/mL标记的软骨细胞,其条带的灰度值比值与未标记软骨细胞比较无明显差异[(27.32±1.02)％ vs(28.56±1.15)％,P＞0.05].结论 PEI-SPIO可达到安全有效标记软骨细胞的要求,PEI-SPIO标记液为6μg/mL,标记24 h是PEI-SPIO标记软骨细胞的适宜标记浓度和标记时间,既可达到标记软骨细胞的目的,又不对软骨细胞的活性、增殖和Ⅱ型胶原蛋白基因的表达造成影响.
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核心蛋白聚糖抑制人软骨细胞MMP13基因表达的体外研究
目的 体外原代细胞培养人正常关节软骨细胞,观察不同浓度的外源性核心蛋白聚糖(decorin,DCN)对软骨细胞基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteases 13,MMP13)表达的影响.方法 采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶结合消化法分离培养人透明软骨细胞,观察体外培养的软骨细胞形态,阿尔新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定透明软骨细胞,从基因水平(实时定量PCR)检测不同浓度的外源性DCN(对照组:0,A组:2.5μg/ml,B组:25 μg/ml,C组:250 μg/ml)作用下透明软骨细胞对MMP13、X型胶原(Collagen X)表达的影响.结果 ①正常透明软骨细胞培养呈多角型,扁平状,换液培养5d时,细胞呈多边形、星形等,排列紧密呈“铺石板”样.②本法分离培养的原代透明软骨细胞的阿尔新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性.③随着外源性DCN浓度(0～250μg/ml)的不断增大,Collagen X的表达明显降低(P＜0.01),且成剂量依赖关系(A:0.78±0.03,B:0.71±0.04,C:0.63±0.01),MMP13的表达则在DCN高浓度组(250 μg/ml)时明显降低(0.85±0.02,P＜0.01).结论 外源性DCN抑制透明软骨细胞的Collagen X的表达且成剂量依赖关系,高浓度(250μg/ml)对MMP13的表达起明显抑制作用.表明外源性DCN可能通过抑制透明软骨细胞肥大化抑制软骨细胞MMP13的表达.
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体外持续传代引起小鼠透明软骨细胞表型和细胞外基质平衡变化的研究
目的：研究体外持续传代对透明软骨细胞形态表型、分化特性及细胞外基质（ECM）平衡状态的影响。方法酶消化法分离培养小鼠透明软骨细胞，连续传代至第5代。采用苏木精-伊红染色观察软骨细胞的形态改变，采用半定量聚合酶链式反应分析软骨细胞特异性基因、常规基因、基质金属蛋白酶家族（MMPs）和基质金属蛋白酶组织抑制剂家族（TIMPs）mRNA水平的变化，采用明胶酶谱分析鉴定软骨细胞明胶酶活性的改变。结果随着传代次数增加，软骨细胞形态由圆形或多边形变为长梭形，其特异性基因的表达量明显下降（P<0.05），至第5代已基本丧失。相比而言，常规基因的下调并不明显。MMPs和TIMPs均有下调（P<0.05），仅MMP-1和TIMP-1改变的差异无统计学意义（P>0.05）；MMPs/TIMPs比值随传代发生紊乱。在蛋白质水平，随传代次数增加，明胶酶的活性下降，P4和P5代细胞下调显著（P<0.05）。结论软骨细胞在体外培养过程中，其特异性表型特征会随传代次数增加而逐渐丧失，软骨细胞发生反分化而表现出纤维化趋势。同时，ECM的平衡状态被打破，合成与分解代谢紊乱。在利用软骨细胞进行相关疾病的研究或软骨组织工程学实验时，应选用前3代的软骨细胞。
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一例自体透明软骨细胞移植手术的配合
透明软骨细胞移植是通过自身透明软骨细胞体外培养,移植回体内从而再生为与自体软骨生物特性基本一致的透明软骨.它是治疗剥脱性软骨炎、关节内软骨缺损的一种新方法.
