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刺五加Actin基因cDNA全长序列的克隆与生物信息学分析
目的：克隆刺五加Actin基因的全长cDNA序列，并对其进行生物信息学分析。方法：以刺五加的叶片为材料，提取总RNA，逆转录为cDNA，根据初步克隆到的刺五加Actin基因保守序列设计引物，利用套式PCR进行3'和5'RACE扩增，得到Actin基因的3'和5'端cDNA序列片段，拼接获得cDNA全长。将该序列进行BLAST比对、相似度分析，并对刺五加Actin1蛋白的二级结构和三级结构进行预测。结果：刺五加的Actin基因全长1507 bp，命名为ESA ctin1，注册号KC469585。该基因开放阅读框（ORF）长1134 bp，编码377个氨基酸，5'端非编码区长140 bp，3'端非编码区长233 bp。ESActin1与GenBank 中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在75%以上，蛋白质序列的相似性在94%以上。结论：首次报道了刺五加Actin基因的全长cDNA序列，为刺五加的分子生物学研究奠定基础。
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人脂联素基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建
目的:克隆不同长度人脂联素基因(AD)启动子片段,构建含人AD启动子片段的荧光素酶报告基因载体并进行测序鉴定.方法:利用PCR技术从人全血基因组DNA中扩增出AD启动子片段,经纯化酶切后克隆入载体pGL-3 basic中,形成重组质粒,筛选阳性克隆进行测序,并与GenBank比对.结果:从人全血基因组DNA中PCR扩增得到1.1 kb和2.1 kb AD启动子片段,构建2种报告基因载体,将其命名为AD promoter1.1-pGL-3 basic和AD promoter2.1-pGL-3 basic,经测序证实所插入的目的片段与GenBank检索的人AD启动子序列99.6％匹配.结论:成功构建了含人AD启动子片段的报告基因载体.
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补肾活血方对老年自发性高血压大鼠血清抗衰老因子Klotho含量的研究
Klotho (KL)基因是Kuro-o等[1]在1997年从表现为衰老的模型小鼠中克隆成功,随后发现人和大鼠中也存在KL基因.Klotho基因缺失鼠(KL-/-)的表型类似人类的衰老表现,包括寿命缩短、动脉硬化等[2-4].反之,Klotho高表达可延长实验动物的寿命,说明它是一个衰老抑制基子.KL基因可通过选择性拼接产生两种蛋白产物上,一种为跨膜蛋白,一种为分泌型KL蛋白,它以游离的形式发挥功能,在人组织及血清中中可检测到其存在[5].
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雷公藤单加氧酶基因全长克隆及表达分析
目的:单加氧酶(Monooxygenase,MO)是一类通过在底物上加一个氧原子的加氧酶,在动植物体内参与多种代谢途径.本实验致力于从雷公藤转录组数据中克隆得到单加氧酶基因cDNA全长,并对克隆得到的MO基因进行初步的功能分析.方法:通过对雷公藤转录组数据中筛选得到MO基因片段设计特异性引物,克隆MO基因cDNA全长,通过生物信息学方法对得到的MO基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等.结果:根据分析结果TwMO基因全长为2193 bp,共编码507个氨基酸,等电点为8.84,相对分子质量为55.20 kDa,多重序列比对显示它与其他植物的MO基因具有较高的同源性.雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,实时荧光定量结果显示,Tw-MO的表达量明显增加,并在48 h达到高,提示TwMO基因与雷公藤的次生代谢产物的生成有关.结论:本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到MO基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础.
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光果甘草CHS基因的克隆与多态性分析
目的:克隆光果甘草Glycyrrhiza glabra查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因并分析其基因多态性.方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从光果甘草主根中扩增得到CHS cDNA序列,测序并运用生物信息学软件对测序结果进行分析.结果:克隆得到19条长度为1 175 bp的光果甘草CHS cDNA序列,测序结果显示其一致性99.10％,存在81个变异位点,可分为17种单倍型;氨基酸序列分析显示,这19条cDNA序列共编码14种氨基酸序列类型,一致性99.34％,存在25个变异位点.生物信息学分析表明光果甘草CHS cDNA序列编码蛋白为稳定性亲水蛋白,平均相对分子质量42.6 kDa,等电点5.75～6.21,不含信号肽,无跨膜区,保守结构域包含1个查尔酮合酶超家族结构域,二级结构以α螺旋和无规卷曲为主.同源性分析显示,光果甘草CHS cDNA序列与乌拉尔甘草G.uralensis以及胀果甘草G.inflata在进化关系上近,与小立碗藓Physcomitrella patens在进化关系上远.结论:成功克隆并得到了光果甘草CHS cDNA序列,且这些序列编码区具有丰富的多态性.
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三种差异表达基因克隆方法的比较
为了能快速、有效、准确地克隆出有意义的基因,本文就常用的三种基因克隆方法,即差异显示PCR、抑制性消减杂交、PAP-PCR,从其原理、应用、优越性、主要缺陷等几方面进行了简要概述.这些方法为中医、针刺治疗各种疾病过程中有关的基因差异表达,以及有关基因分子克隆提供有效的分子生物学工具.
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半夏中的活性成分生物碱及其蛋白基因研究
目的:研究半夏属中药凝集素的序列分析以及基因片段的克隆.方法:参照已知半夏中凝集素的基因序列进行引物设计,选择RT-PCR法,自三叶半夏、掌叶半夏、盾叶半夏、石蜘蛛半夏、滴水珠半夏中分别克隆出凝集素的基因片段(长度为530bp),选择Proteomics Ex2PASy Server,finderORF,Genescan 3种软件对凝集素的基因片段分别给予分析.结果:基因片段的编码分别为三叶半夏170个氨基酸,掌叶半夏170个氨基酸,滴水珠半夏170个氨基酸,石蜘蛛半夏171个氨基酸,盾叶半夏107个氨基酸,并且所编码肽链当中均具有功能位点,如糖基化N位点、磷酸化蛋白激酶C位点和磷酸化酪蛋白激酶Ⅱ位点.因为编码序列当中突变的碱基因素,导致肽链氨基酸出现变化,因此具有多态性,且功能位点也存在差异.结论:中药半夏的凝集素基因能够成功克隆,但是否能够成功转移到其他药材植物当中,以此来获得新的抗虫中药植株,还有待进行更深层次的研究.
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环孢菌素A加中药治疗骨髓增生异常综合征
骨髓增生异常综合征(MDS)是造血系统异质性克隆增殖性疾病,治疗有效率低,死亡率较高,是血液系统疾病治疗的重要研究课题.在MDS发病机理的研究中发现,存在细胞免疫和体液免疫功能异常以及造血细胞显示过度凋亡以致产生代偿性无效造血.
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雷公藤乙酰CoA酰基转移酶基因全长cDNA克隆及表达分析
研究根据雷公藤悬浮细胞转录组数据库设计引物,对雷公藤悬浮细胞乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyl-transferase)基因TwAACT进行全长cDNA(GeneBank:KP297934)克隆以及生物信息学分析和基因表达分析.克隆得到TwAACT cDNA全长为1 704 bp,编码405个氨基酸,等电点为6.10,相对分子质量为41.20 kDa,在线预测表明TwAACT具有2个催化活性位点.雷公藤悬浮细胞经茉莉酸甲酯(MeJA)外源诱导后,通过荧光定量PCR表明,TwAACT相对表达量明显增加,在24h达到高.研究首次克隆得到雷公藤AACT基因,为进一步阐述雷公藤萜类生物合成途径奠定基础.
关键词： 雷公藤 乙酰CoA酰基转移酶 克隆 生物信息学分析 基因表达分析 -
刺五加鲨烯环氧酶基因cDNA的克隆及序列分析
目的:对刺五加鲨烯环氧酶基因的cDNA进行克隆及序列分析.方法:采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参SE基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SE基因的cDNA序列.结果:克隆了2个序列不同的cDNA(SE1和SE2),开放阅读框分别长1 665,1 629 bp,分别编码554,542个氨基酸.SE1,SE2间的核苷酸和氨基酸一致性分别为91.49％,92.55％,两者与三七SE1的氨基酸序列相似性高,分别为93.45％,94.87％.SE1,SE2均含有1个FAD结合区域,SE1,SE2推测的氨基酸分别存在2个和4个跨膜螺旋.结论:首次分离并报道了刺五加的2个SE基因cDNA序列,为刺五加的次生代谢工程研究奠定了基础.
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地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析
酪氨酸脱羧酶TyDC是植物次生代谢的催化酶,在苯乙醇苷类成分的生物合成中发挥重要作用.根据地黄转录组数据,克隆了地黄酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC的全长cDNA序列(GenBank登录号KU640395),并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在地黄不同组织及4种诱导子处理后毛状根中的表达量.结果表明,RgTyDC ORF为1 619 bp,编码509个氨基酸,相对分子质量为56.6 kDa,等电点pI 6.25.RgTyDC与芝麻酪氨酸脱羧酶SiTyDC和猴面花酪氨酸脱羧酶EgTyDC的同源性高,均为88％.RgTyDC基因在叶片(尤其是衰老的叶片)中表达量较强,在块根中表达量较低.SA和MeJA处理后显著上调表达.这为进一步研究RgTyDC在地黄苯乙醇苷类成分生物合成中的分子功能奠定基础.
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刺五加钙调蛋白基因的克隆及内生真菌对其表达的影响
目的:克隆刺五加的钙调蛋白( calmodulin,CaM)基因,并分析内生真菌对其表达的影响.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加CaM基因的全长cDNA序列.通过RT-PCR法检测可显著提高刺五加皂苷含量的内生真菌菌株P116-1a,P116-1b,P109-4,P312-1对CaM表达的影响.结果:刺五加CaM基因的cDNA全长为856 bp,开放阅读框长450 bp,编码149个氨基酸的蛋白,与人参Panax ginseng和胡萝卜Daucus carota等物种的CaM同源性均高达100％.RT-PCR的结果显示,内生真菌可显著提高刺五加CaM基因的表达量(P＜0.05),大表达量出现在菌株P109-4回接90 d时,达对照的2.96倍.结论:首次克隆并报道了刺五加CaM的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加CaM基因的表达量,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷含量的机制奠定了基础.
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黄芩葡萄糖醛酸水解酶基因的克隆、生物信息学分析及表达
该文从黄芩叶中提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆了葡萄糖醛酸水解酶基因(sbGUS)的全长(GeneBank登录号KR364726).该基因全长1 584 bp,含有1个完整的开放阅读框,编码527个氨基酸,为不稳定亲水蛋白.生物信息学分析结果显示sbGUS编码蛋白分子质量为58.724 8 kDa,等电点pI 5.55,含有信号肽和1个跨膜区,具有1个水解酶超级家族结构域1个未整合的转移糖苷酶催化结构域.二级结构中α-螺旋(Alpha helix)占25.62％,延伸链(extended strand)占28.84％,β-转角(Beta turm)占13.28％,无规卷曲(random coil)占32.26％.序列比对和系统进化分析表明,sbGUS基因与黄芩(BAA97804.1)核苷酸相似性为98.93％、氨基酸相似性为98.29％,在9个位置氨基酸不同.实时荧光定量PCR检测sbGUS在根中表达丰度高,其次为花和茎,在叶中表达量低.这为进一步鉴定sbGUS的功能及开展黄芩素的合成生物学研究奠定基础.
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红花生育酚环化酶基因的克隆及表达分析
生育酚环化酶(tocopherol cyclase,TC)是植物Vit E生物合成途径的关键酶之一.该研究根据红花转录组数据,利用RT-PCR(reverse transcription-PCR)方法从药用植物红花种子中克隆得到生育酚环化酶基因序列,命名为CtTC,对其进行生物信息学分析,结果表明该基因开放阅读框(ORF)为1 524 bp,编码507个氨基酸,相对分子质量为62.9 kDa,等电点(theoretical pI)为5.01.跨膜结构分析表明TC存在跨膜结构.蛋白糖基化位点分析表明TC蛋白含有1个丝氨酸糖基化位点以及1个苏氨酸糖基化位点.亚细胞定位表明其定位于叶绿体中.利用荧光定量PCR检测红花不同发育时期种子以及干旱胁迫不同时间的红花叶片中TC基因的表达量,结果表明TC基因在红花的开花后50 d的种子中表达量高,干旱胁迫6d时TC基因的表达量达到高值,随后下降,为TC基因在红花Vit E合成以及抵抗逆境胁迫中的功能研究奠定基础.
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刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、生物信息学及表达分析
目的:克隆刺五加的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加FPS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能.并通过RT-PCR法检测FPS在不同器官中的表达情况.结果:刺五加FPS基因的cDNA全长为1 499 bp,开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸的蛋白,包含2个富含天冬氨酸(DDXXD)的保守功能域.FPS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加FPS基因在各器官中均有表达,但表达具有显著差异(P＜0.05).结论:首次分离并报道了刺五加FPS的cDNA克隆,并证实其在不同器官中的表达量不同,为进一步研究FPS对刺五加皂苷合成的影响和表达调控奠定了基础.
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菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT基因的克隆和表达分析
根据菘蓝转录组数据,克隆了菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT的全长cDNA并进行生物信息学分析,进一步利用实时荧光定量PCR技术分析了IiHCT基因的表达模式.IiHCT ORF为1 290 bp,编码430个氨基酸,等电点为5.77,相对分子质量为47.68 kDa.IiHCT主要在菘蓝茎中表达,幼根、叶、花蕾中几乎不表达.同时发现离体菘蓝毛状根中可以检测到IiHCT的表达,外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,IiHCT相对表达量明显增加,在4h达到原先的4.3倍.研究首次从菘蓝中克隆得到HCT基因,为进一步解析菘蓝苯丙素类成分的生物合成途径奠定基础.
关键词： 菘蓝 莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶 克隆 实时定量PCR 表达分析 -
雷公藤牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因全长cDNA的获得及生物信息学分析
该研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条GGPPS全长cDNA(GeneBank:KM978333),并对其进行多重序列比对、蛋白结构预测及构建系统进化树等生物信息学分析.所克隆的TwGGPPS cDNA全长1 857 bp,编码含514个氨基酸的蛋白序列,相对分子质量为57.13 kDa,等电点为7.85,具有5个保守域和2个功能域,亚细胞定位预测显示其可能位于质膜上,多重序列比对及系统进化树结果显示与其他植物GGPPS家族具有较高同源性.实验首次克隆了雷公藤GGPPS基因,为进一步研究雷公藤甲素等二萜化合物生物合成途径奠定基础.
关键词： 雷公藤 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 克隆 生物信息学分析 -
白花丹参鲨烯合酶SQS2的克隆与原核表达分析
该研究根据丹参的转录组数据提供的基因片段设计引物,采用逆转录聚合酶链式反应方法,从白花丹参中克隆鲨烯合酶SQS2的全长cDNA序列,命名为SmSQS2,GenBank注册号KM244731.序列长度为1 597 bp,包含1 245 bp的开放阅读框,推测编码414个氨基酸,含有115 bp的5'UTR和237 bp的3'UTR.利用生物信息学软件对获得的序列进行同源性分析,得出白花丹参SQS2的与紫花丹参SQS2的序列无明显差异.原核表达分析结果表明SmSQS2在大肠杆菌中能表达出与预测蛋白大小相当的目标蛋白,对影响蛋白表达的4个因素,即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度和诱导时宿主菌的吸光度(A600)进行了优化,得出SmSQS2蛋白表达的佳条件为:IPTG终浓度0.2 mmol· L-1,宿主菌的吸光度(A600)为0.6,温度30℃,诱导时间20 h.这为进一步研究白花丹参鲨烯合酶SQS2在丹参萜类和甾醇类生物合成途径中的作用提供了理论依据.
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雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析
根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆TwMCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR),以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后0～ 72 hTwMCT基因的相对表达量.克隆得到全长1 318 bp TwMCT全长cDNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24h时达到高值.克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件.
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丹参转录因子SmbHLH1基因的克隆和表达分析
目的:获得丹参转录因子SmbHLH1全长基因,分析SmbHLH1基因在丹参不同组织部位,以及不同诱导子处理后的表达差异.方法:利用RT-PCR等技术获得SmbHLH1基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmbHLH1基因在丹参不同部位的表达情况,及在不同处理条件下的表达情况.结果:获得的SmbHLH1基因由999个核苷酸组成,编码332个氨基酸,蛋白相对分子质量约36 kDa；半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量高,其次是茎,在叶和花中有微量表达；茉莉酸甲酯,以及酵母提取物和Ag+共同诱导,会抑制该基因的表达,水杨酸和脱落酸对该基因的影响不大.结论:丹参SmbHLH1基因是bHLH家族新成员,其功能可能与油菜素内酯信号途径有关.
