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PRL-1基因3'UTR荧光素酶报告基因载体及突变体的构建
目的针对促肝细胞再生磷酸酶1 (phosphatase of regenerating liver-1,PRL-1)3'端非翻译区(3-untranslatedregion,3'UTR)构建PRL-1荧光素酶报告基因载体及突变体,为研究miR-339-5p在结肠癌中调控其靶基因PRL-1提供有效的工具.方法PCR扩增包含PRL-1的3'UTR的DNA片段,克隆至荧光素酶载体psiCHECK-2,构建psiCHECK-2/PRL-13'UTR载体;经双酶切及测序鉴定后,对psiCHECK-2/PRL-1 3'UTR重组质粒“种子区”的7个碱基进行定点突变,构建psiCHECK-2/PRL-1 3'UTR突变载体.结果 克隆获得的psiCHECK-2/PRL-1 3'UTR载体中DNA片段大小及序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确.“种子区”的7个碱基定点突变成功.结论成功构建了含PRL-1基因3'UTR区的荧光素酶报告基因载体及突变体,可用于后续功能研究.
关键词： 促肝细胞再生磷酸酶1 荧光素酶报告基因质粒 定点突变 -
慢病毒介导shRNA特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1基因表达抑制舌癌细胞迁移侵袭能力
目的:探讨特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1 (phosphatase of regenerating liver cell-1,PRL-1)基因表达对舌癌细胞迁移、侵袭能力的影响.方法:设计、合成5条针对PRL-1基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列,构建于慢病毒载体质粒中,PCR电泳及基因测序验证.转染293T细胞,Western blot筛选佳干扰序列,包装产生慢病毒.转染TCA8113细胞,筛选、建立稳定转染细胞株;real-time PCR检测PRL-1基因沉默效率;划痕实验和Transwell实验分别比较慢病毒转染细胞(KD组)、空病毒转染细胞(NC组)及TCA8113细胞(CON组)迁移、侵袭能力变化.结果:PCR电泳及基因测序证实5条shRNA序列定向插入慢病毒载体质粒中.Western blot筛选出PRL-1-shRNA-1基因沉默效率高,包装获得慢病毒滴度为7×108 TU/ml.通过转染、筛选,建立了TCA8113细胞稳定转染细胞株;real-time PCR测得PRL-1基因mRNA表达明显下降(F=809.120,P=0.000);PRL-1基因沉默后细胞迁移能力降低,穿过人工基底膜的细胞数KD组(25.5±0.4)明显少于NC组(81.5±2.0)和CON组(88.5±2.3)(F=1 092.970,P=0.000).结论:沉默PRL-1基因表达能有效抑制舌癌细胞迁移、侵袭能力.
