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稳定表达 Notch1胞内结构域肺腺癌细胞株的构建及鉴定
目的：构建Notch1胞内结构域（ N1ICD）稳定表达的肺腺癌A549细胞株。方法采用PCR方法扩增N1ICD基因，构建慢病毒重组质粒pHBLV-N1ICD-ZsGreen-Puro（LV-N1ICD），采用PCR和基因测序鉴定重组质粒。高纯度无内毒素抽提慢病毒重组质粒和辅助包装原件载体质粒，使用慢病毒空载质粒（ LV-ZsGreen-Puro）和LV-N1ICD共转染293T细胞包装慢病毒，利用药物筛选法测定病毒滴度。将A549细胞分成A549-N1ICD组和A549-ZsGreen-Puro组，分别加入LV-N1ICD和LV-ZsGreen-Puro，取制备好的慢病毒感染A549细胞，加入嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株，荧光显微镜观察转染效率，以带有绿色荧光的细胞初步视为稳定转染的细胞株。以A549细胞为对照组，进一步采用qPCR和Western blot方法分别检测N1ICD mRNA及蛋白表达。结果 PCR及基因测序结果表明pHBLV-N1ICD-ZsGreen-Puro重组质粒构建成功。 LV-N1ICD组病毒滴度为1×108 TU／mL，LV-ZsGreen-Puro组病毒滴度为1×108 TU／mL。经嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察细胞形态无明显变化，A549-ZsGreen-Puro组和A549-N1ICD组70％～80％的细胞带有绿色荧光。对照组、A549-ZsGreen-Puro组、A549-N1ICD组的N1ICD mRNA相对表达量分别为1．59±0．11、1．09±0．10、70．81±6．39，A549-N1ICD组高于其他两组（P均＜0．01）。三组N1ICD蛋白相对表达量分别为1．99±0．13、1．73±0．08、6．58±0．43，A549-N1ICD组高于其他两组（P均＜0．01）。结论成功构建了稳定表达N1 ICD的肺腺癌A549细胞株。
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Notch1胞内结构域真核表达质粒构建及在H9c2心肌样细胞的表达和生物学功能
目的 构建Notch 1胞内结构域(N1ICD)真核表达质粒,确定能在H9c2心肌样细胞内表达,并发挥生物学效应,为后续Notch1信号通路的研究提供实验依据.方法 设计并合成1对含有BamH Ⅰ和EcoR I酶切位点的特异性引物,以小鼠cDNA文库为模板,经PCR扩增得到了1 122 bp的目的片段,定向克隆至pcDNA 3.1/myc-His质粒,构建pcDNA3.1/N1ICD-myc-His真核表达质粒.通过双酶切及基因测序鉴定,经Lipofectamine 2000转染至H9c2心肌样细胞,48 h后提总蛋白,Western-blotting检测myc和Hes1,确定N1ICD能在H9c2细胞表达,并启动下游基因表达.结果 表达质粒pcDNA3.1/N1ICD-myc-His双酶切及基因测序正确,N1ICD可在H9c2心肌样细胞内高效表达,具有Notch1生物学效应.结论 真核表达质粒pcDNA3.1/N1ICD-myc-His构建成功,为Notch1信号通路在心血管领域的功能研究奠定了基础.
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Notch1胞内结构域慢病毒表达载体及干扰载体的构建
目的：构建高滴度大鼠N1ICD慢病毒过表达载体（LV-N1ICD）及N1ICD慢病毒干扰载体（LV-N1ICD-shRNA）。方法以大鼠cDNA文库为模板，PCR法扩增N1ICD，通过定向克隆构建pGC-FU-N1ICD-3Flag穿梭质粒；设计4对N1ICD-shRNA寡核苷酸序列，以构建GVC112-N1ICD-shRNA干扰质粒，将pGC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-shRNA共转293T细胞，检测Flag的表达，筛选理想的GVC112-N1ICD-shRNA干扰质粒。将pGC-FU-N1ICD-3Flag或GVC112-N1ICD-shRNA与pHelper 1.0、pHelper 2.0共转293T细胞，以包装LV-N1ICD和LV-N1ICD-shRNA，分别利用Real-time PCR、药物筛选法进行病毒滴度测定。LV-N1ICD及LV-N1ICD-shRNA分别感染H9c2心肌细胞，利用CCK-8检测细胞活力。结果 pGC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-shRNA质粒经PCR、基因测序及Western-blotting验证构建成功，与pHelper 1.0、pHelper 2.0共转293T细胞后，取上清浓缩，分别获得高滴度LV-N1ICD和LV-N1ICD-shRNA。LV-N1ICD可明显提高心肌细胞活力，LV-N1ICD-shRNA可降低心肌细胞活力。结论 LV-N1ICD和LV-N1ICD-shRNA包装成功，具有Notch1信号通路生物学功能。
