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TFⅡH参与调控RNA聚合酶Ⅱ介导的mRNA转录的研究进展
通用转录因子TFⅡH (transcription factor ⅡH)在RNA聚合酶Ⅱ (RNA Pol Ⅱ)介导mRNA的转录中起着非常重要的作用,且主要是通过磷酸化RNA Pol Ⅱ大亚基的羧基末端结构域(CTD)的各个位点来调控转录过程.转录启动前,TFⅡH及其他转录因子与RNA Pol Ⅱ结合形成转录起始前复合物(preinitiation complex,PIC),而后TFⅡH的亚基CAK通过磷酸化RNAP Ⅱ CTD的第五位丝氨酸(Ser5)和第七位丝氨酸(Ser7)促进转录的起动.而CAK磷酸化Ser5的同时也能够促使另一个激酶CDK9磷酸化RNAP Ⅱ CTD的第二位丝氨酸(Ser2),该过程参与调控转录的延伸以及终止.
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人XPD基因转染对人肝癌细胞的生物学影响
目的:XPD基因作为TFIIH因子中一员,在基因修复中发挥重大作用.本实验构建带有绿色荧光蛋白表达人野生型XPD基因重组质粒pEGFP-N2-XPD,并将其稳定转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞,探讨XPD基因与HBx,Cdk7的相互作用,以及细胞周期和凋亡机制.方法:从人宫颈鳞癌上皮细胞株HeLa细胞克隆出人全长XPD cDNA,构建了pEGFP-N2-XPD重组体质粒,并将其稳定转染入Hep3B并筛选单克隆稳定转染重组质粒Hep3B细胞(Hep3B-pEGFP-N2/XPD)和稳定转染空载质粒Hep3B细胞(Hep3B-pEGFP-N2).利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白表达,检测转染XPD基因后细胞内XPD,HBx,Cdk7的表达量变化,并检测细胞的增殖凋亡以及细胞周期变化.结果:(1)利用酶切和基因测序,成功构建了带有绿色荧光蛋白表达人野生型XPD基因重组质粒pEGFP-N2-XPD.(2)免疫荧光显微镜下,Hep3B-pEGFP-N2和Hep3B-pEGFP-N2-XPD细胞中可观察到绿色荧光蛋白表达.(3)RT-PCR检测:Hep3B-pEGFP-N2/XPD细胞与Hep3B和Hep3B-pEGFP-N2,两对照组相比,HBx mRNA表达明显降低(P＜0.001) XPD mRNA表达明显增高(P＜0.01) Cdk7 mRNA表达明显降低(P＜0.001).(4) MTT检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD与两对照相比,细胞增殖率减弱(P＜0.05).TUNEL检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD与两对照组比较,细胞凋亡明显增加(P＜0.01).流式细胞仪检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD进入S期出现障碍,停滞在G0 +G1期的细胞增多,细胞凋亡率逐渐增加.(5)Western blot检测Hep3B-pEGFP-N2/XPD细胞中XPD蛋白相对表达量均比两对照组高,Cdk7蛋白相对表达量均比两对照组低,差异有统计学意义(P＜0.001).结论:野生型XPD基因片段成功插入pEGFP-N2空载质粒中,将其稳定转染进人肝癌细胞株Hep3B细胞中,可以在转录和蛋白水平提高细胞XPD表达、降低细胞内HBx Cdk7表达.野生型XPD基因过渡表达可能抑制HBx Cdk7表达来改变细胞周期、抑制细胞生长、促使细胞凋亡.
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microRNA-199a-3p靶向CDK7对膀胱肿瘤细胞增殖的影响
目的 探讨 microRNA-199a-3p 对膀胱肿瘤细胞增殖的影响及其作用机制. 方法 应用逆转录实时定量PCR检测膀胱肿瘤新鲜组织中 miR-199a-3p 及 CDK7 的表达水平,并对二者的表达进行相关分析.逆转录实时定量PCR验证转染体系的有效性;增殖实验明确 miR-199a-3p对膀胱肿瘤细胞的影响;荧光素酶报告系统证实 miR-199a-3p对CDK7 3′UTR的靶向作用;免疫印迹实验验证 miR-199a-3p对CDK7 蛋白水平的影响;后行功能回复实验. 结果 膀胱肿瘤新鲜组织中 miR-199a-3p的表达较正常对照明显降低,CDK7 的表达则明显增加,两者呈负相关关系;miR-199a-3p类似物和抑制剂转染成功后能明显上调或下调 miR-199a-3p 的表达;miR-199a-3p 可以明显抑制膀胱肿瘤细胞的增殖,而 miR-199a-3p抑制剂可以促进其增殖;荧光素酶报告系统证实miR-199a-3p与CDK7 的3′UTR靶向结合,同时miR-199a-3p可以明显抑制膀胱肿瘤细胞CDK7 的表达;CDK7 可以回复或者部分回复 miR-199a-3p 对膀胱肿瘤细胞的增殖抑制作用. 结论 microRNA-199a-3p可通过靶标基因CDK7 实现其对膀胱肿瘤细胞的增殖抑制作用.
关键词： miR-199a-3p CDK7 膀胱肿瘤 增殖 靶向 -
CDK7抑制剂THZ1对乳腺癌细胞增殖与凋亡的作用及其机制
目的 探讨细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶7(CDK7)特异性抑制剂THZ1对人乳腺癌细胞系MCF7、SkBr3及Hs578T增殖及凋亡的作用及其分子机制.方法 采用MTT、流式细胞术、Western blot等方法检测细胞活力、细胞周期和凋亡的变化情况.结果 500 nmol/L THZ1处理细胞,显微镜观察细胞数明显减少;MTT实验表明THZ1呈剂量及时间依赖性抑制细胞的增殖;细胞饥饿培养24 h以同步化在G1/S期,THZ1继续处理24 h,流式细胞术检测G2/M期细胞数增多.THZ1引起细胞G2/M期阻滞;THZ1呈剂量及时间依赖性诱导细胞早期凋亡与晚期凋亡;Western blot结果表明,THZ1可导致Cleaved-PARP上调,Bcl-2的显著下调和p65、GSK3蛋白磷酸化水平的明显上调.结论 THZ1能抑制MCF7、SkBr3及Hs578T细胞增殖,诱导其细胞周期阻滞及细胞早、晚期凋亡,可作为乳腺癌治疗潜在的候选药物.
