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Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白在急性缺氧性细胞损害中的表达调节机制研究
目的:探讨Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白(ABAD)的基因表达调控机制及其对缺氧反应的分子生物学机理.方法:根据Genebank中包含ABAD基因全长序列的DNA序列设计引物,PCR扩增ABAD基因上游启动子区全长2055bp之片段,并将其亚克隆至荧光酶报告载体Luciferase pGL3中的NheI/SmaI位点,构建ABAD启动子-pGL3表达质粒(P-2055)及5′-端截短的ABAD启动子-pGL3表达载体(P-1453,P-128).用脂质体Lipofectmine 2000将1μg待转染的空pGL3表达载体DNA(阴性对照)及ABAD全长和5′截短启动子-pGL3表达质粒DNA(P-2055,P-1453, P-128)转染至对数生长的COS-1细胞中.细胞转染后48 h,收集细胞,裂解,提取蛋白,以Dual-luciferase reporter 系统为底物并采用荧光测定仪测定荧光酶活性.采用相对活性方法比较全长和截短的ABAD启动子活性,以确定核心启动子序列.采用缺氧箱分别诱导细胞缺氧后,测定ABAD核心启动子序列的活性改变.结果:ABAD全长启动子-pGL3表达质粒(P-2055)的荧光酶活性较pGL3空表达载体高300倍以上(P＜0.001).该全长启动子截短至-128 bp(P-128)时,活性仍为全长序列的105%,而将该128bp序列去除后,其活性几乎全部消失.ABAD核心启动子序列(P-128)经缺氧处理1、4、8、16 h后,其活性分别降为正常氧状态的(64.5±1.7)%、(51.4±1.6)%、(17.8±1.1)%、(8.3±0.3)%,各缺氧时间点相对活性与正常氧状态相比,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:ABAD上游128 bp为该基因的核心启动子序列,决定了ABAD的表达活性.该启动子对缺氧高度敏感,其对缺氧的反应是ABAD缺氧性改变的主要分子机理.
关键词： Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白 细胞 缺氧 表达调节 -
Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白在缺氧性细胞中的表达及其对细胞缺氧性损害的保护作用
目的 研究Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白(ABAD)在缺氧性细胞中的表达及其对细胞缺氧性损害的保护作用,以探讨急性缺氧性疾病的治疗新方法.方法 ①观测缺氧状态下细胞Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白表达水平的变化:体外培养的COS-1细胞置于缺氧箱诱导缺氧1～16 h(氧浓度控制1%～2%),收集细胞,裂解,离心得到蛋白提取液,同时用TRIzol方法提取总RNA;Northern blot法检测正常和缺氧状态下细胞ABAD mRNA的表达水平;15 μg总RNA于10%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离并转移至尼龙膜,采用QuikHyb快速杂交系统与α-32P标记的全长ABAD cDNA探针杂交,杂交膜于-80℃放射自显影18 h;Western blot检测正常和缺氧状态下细胞ABAD蛋白的表达水平:20 μg蛋白样品于SDS-NuPAGE胶电泳分离,电转移使样品印迹至尼龙膜上,后者依次与鼠抗人ABAD单克隆抗体(一抗)和兔抗鼠抗体(二抗)孵育,用化学发光法显示印迹条带;②观测上调ABAD表达对细胞缺氧性损害的影响:采用逆转录PCR(RT-PCR)方法,扩增ABAD全长编码序列,PCR产物直接克隆至pcDNA3表达质粒中,构建ABAD-pcDNA3表达质粒;将1 μg pcDNA3-ABAD表达质粒DNA用Lipofectmine 2000转染剂转染至COS-1细胞株,培养36 h.正常对照组则以1 μg pcDNA3空载体转染;转染后细胞按上述方法进行缺氧处理,收集细胞,裂解,采用DNA片段化检测试剂盒定量检测ABAD正常表达和高表达条件下缺氧诱导的细胞死亡事件.结果 与正常表达组相比,ABAD mRNA及蛋白水平均于缺氧后1 h开始下降,4～8 h后显著降低,至16 h表达几乎完全消失;提高ABAD的表达可明显降低缺氧所致的DNA片段化水平(P＜0.05).结论 ABAD是缺氧高度敏感性蛋白,同时又是一个对缺氧性损害有明显保护作用的蛋白.因此,它可望成为急性缺血缺氧性疾病临床监测的一个新指标,并具有潜在治疗应用价值.
关键词： Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白 细胞 缺氧 损害 保护作用
