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RT-PCR法检测外周原始神经外胚叶瘤石蜡包埋组织中EWS-FLI1融合基因
目的研究嵌套式逆转录-聚合酶链反应(nested RT-PCR)方法检测外周原始神经外胚叶瘤石蜡包埋组织中EWS-FLI1融合基因的可行性和临床意义.方法收集12例外周原始神经外胚叶瘤及8例对照肿瘤标本,均为福尔马林固定石蜡包埋组织.EWS-FLI1融合基因检测方法采用嵌套式RT-PCR法.看家基因β-actin为内参照.结果 9例标本检测到β-actin片断,6例检测到EWS-FLI1融合基因表达,其中,"1型"4例,"2型"2例.8例对照肿瘤中未检测到EWS-FLI1基因.结论在外周原始神经外胚叶瘤石蜡包埋组织中,用嵌套式RT-PCR检测EWS-FLI1融合基因是可行的方法,检测结果对肿瘤鉴别诊断和预后判断有意义.
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尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建及鉴定
目的:构建尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒.方法:从人尤文肉瘤A673细胞中提取总RNA,以RT-PCR法扩增EWS-FLI1基因序列,目的基因两侧引入Sac Ⅰ和HindⅢ酶切位点,克隆至pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆作PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定.再将EWS-FLI1基因亚克隆至原核表达载体pQE30中,构建重组原核表达质粒pQE30-EWS-FLI1,酶切及测序鉴定.所构建的重组质粒转化JM109,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,进行Western blot鉴定.结果:PCR结果显示扩增片段大小约为1.5 kb,双酶切鉴定目的基因片段大小约为1.5 kb,阳性克隆测序结果显示目的基因序列与预期相同.所构建重组质粒在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的54 kD蛋白,经鉴定系EWS-FLI1蛋白.结论:成功构建了pQE30-EWS-FLI1,并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.
关键词： EWS-FLI1融合基因 尤文肉瘤 原核表达质粒
